植物生理学通讯 第４５卷 第１期，２００９年１月67
磺胺比色法测定植物组织硝酸还原酶活性的改进
李忠光＊， 龚明
云南师范大学生命科学学院， 昆明６５００９２
“植物组织硝酸还原酶（ＮＲ）活性的测定”是植
物生理学矿质营养一章中必做的实验， 其目的是让学生掌握植物硝酸还原酶（ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ， ＮＲ， ＥＣ．１．６．６．１）活性测定的原理和技术方法， 进一步了解ＮＲ在植物氮素同化过程中的作用（白宝璋和汤学军１９９３； 李合生等２００１； 郝建军等２００７）。但是， 在实验教学中， 我们感到， 按照几种植物生理学实验指导书中介绍的方法（白宝璋和汤学军１９９３； 李合生等２００１； 郝建军等２００７）测定ＮＲ活性， 测得的ＮＲ活性很低， 有时甚至检测不出来。因此我们对此方法的显色液配方、显色时间、三氯乙酸对显色反应的影响和实验材料的取舍进行了探索， 取得了较好的实验效果。
１ 显色液配方和显色时间的确定
磺胺比色法测定植物组织ＮＲ活性的原理， 是根据ＮＲ还原ＮＯ－３后所产生的ＮＯ－２在酸性条件下首先与磺胺发生重氮化反应形成重氮盐， 后者再进一步与α－萘胺发生偶联反应形成粉红色的偶氮化合物， 通过测定偶氮化合物形成的量来表示硝酸还原酶活性的大小， 因此常用到磺胺和α－萘胺２种显色剂。但是， 我们在实验中发现， 按照实验指导书
中的方法用２５％ ＨＣｌ （Ｖ／Ｖ， 即３ ｍｏｌ·
L－１）分别配制磺胺和α－萘胺２种显色剂， 表现出溶解度小， 反应速度慢， 灵敏度低， 显色时间长（实验指导书中为３０ｍｉｎ）等缺点。在用磺胺比色法测定植物组织ＮＲ活性实验中， 酸度是影响重氮化反应和偶联反应的主要影响因素之一（张志良和瞿伟菁２００３）， 为了找出合适的显色液配方， 也就是合适的显色液酸度， 我
们除了用实验指导书中指定的配方， 即用３ ｍｏｌ·
L－１的ＨＣｌ分别配制磺胺和α－萘胺２种显色剂外， 还用
相同浓度的Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４和ＨＡｃ分别配制显色液，并在２５ ℃下测试它们分别与５ µg·mＬ－１ ＮａＮＯ２显色反应１５ ｍｉｎ和３０ ｍｉｎ的光密度Ａ５２０， 得到表１的结果。从表１可以看出， 随着酸强度的增加， ２个显色时间的Ａ５２０都呈现逐渐下降的趋势， 具体表现
为ＨＡｃ＞Ｈ－１３ＰＯ４＞ＨＣｌ＞Ｈ２ＳＯ４。此外， 以３ ｍｏｌ·L ＨＡｃ为溶剂配制的显色液与５ µg·mＬ－１ ＮａＮＯ２显色反应１５ ｍｉｎ， 其Ａ５２０即可达到最大值， 而其余３种需显色３０ ｍｉｎ， Ａ５２０才能达到最大值， 并且它们的Ａ５２０始终小于ＨＡｃ的， 说明用ＨＡｃ配制的显色液其显色反应速度和灵敏度都明显高于分别以Ｈ２ＳＯ４、ＨＣｌ和Ｈ３ＰＯ４为溶剂配制的。因此， 在植物组织ＮＲ活性
测定中， 以３ ｍｏｌ·
L－１ ＨＡｃ为溶剂配制磺胺和α－萘胺２种显色剂， 不仅可提高显色反应的灵敏度， 而且还可以加快显色反应的速度并缩短显色反应的时
表１ 几种配方的显色液对ＮＯ－２显色速度和灵敏度的影响
Ａ５２０
配方
显色１５ ｍｉｎ 显色３０ ｍｉｎ
实验指导书中的配方３ ｍｏｌ·L－１ ＨＣｌ０．２２８±0．０１１０．４６７±0．０２２改进和新增加的配方３ ｍｏｌ·L－１
Ｈ２ＳＯ４
０．１８２±0．００８０．４４８±0．０１７３ ｍｏｌ·L－１ Ｈ３ＰＯ４０．３２９±0．０１３０．５６１±0．０２５
３ ｍｏｌ·L－１ ＨＡｃ
０．６４８±0．０３１０．６５４±0．０３０
表中数据为重复３次的平均值±标准误。
间， 显色反应时间仅为１５ ｍｉｎ， 光密度Ａ５２０就可达到最大值， 达到事半功倍的效果。２ 三氯乙酸对显色反应的影响
在用活体法测定植物组织ＮＲ活性时， 植物生理学实验指导书中常用终浓度为３％ （１８４ ｍｍｏｌ·Ｌ－１）的三氯乙酸（ＴＣＡ）终止酶促反应（李合生等２００１）。我们在实验中用上述２种显色液（即以３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ或ＨＡｃ为溶剂分别配制磺胺和α－萘胺）在２５ ℃下分别测试了用蒸馏水或１８４ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＴＣＡ配制的５ ｇ·ｍＬ－１ ＮａＮＯ２， 以及用ＴＣＡ终止酶促反应法
（ＴＣＡ终止法）测定蜀葵叶片中的ＮＲ活性（酶促反应
收稿２００８－１０－１９
修定
２００８－１１－１７
资助
云南师范大学综合性和设计性实验研究项目。
＊ Ｅ－ｍａｉｌ： ｚｈｏｎｇｇｕａｎｇ＿ｌｉ＠１６３．ｃｏｍ； Ｔｅｌ： ０８７１－５５１７３９４
68植物生理学通讯 第４５卷 第１期，２００９年１月
时间到后， 立即把被测液从含有实验材料的反应体系中取出的方法称为隔离法）， 显色３０ ｍｉｎ后分别测定其光密度Ａ５２０， 得到表２的结果。从表中可以看出， 与以蒸馏水为溶剂配制ＮａＮＯ２相比， 用ＴＣＡ配制（相当于用ＴＣＡ终止酶促反应）明显降低了Ａ５２０； 类似地， 用ＴＣＡ终止法所测出的Ａ５２０也明显低于隔离法。这些结果说明ＴＣＡ降低了磺胺比色法测定ＮＯ－２的灵敏度， 其原因可能是外加ＴＣＡ后导致反应体系的酸度变大， 从而影响重氮化反应和偶联反应的速度（张志良和瞿伟菁２００３； 表１）。这些结果表明在植物组织ＮＲ活性测定中， 用ＴＣＡ终止反应是不适合的， 否则测定结果将明显偏低， 实验指导书中用ＴＣＡ终止反应值得商榷。为了更准确地测定ＮＲ活性， 酶促反应结束后， 立即将所测液从含有实验材料的反应体系中取出（隔离法）， 从而使底物和ＮＲ分离， 仍可达到终止酶促反应的目的。
表２ ＴＣＡ对磺胺比色法测定ＮＲ活性显色反应的影响
Ａ５２０
测定内容和方法
３ ｍｏｌ·L－１
ＨＣｌ ３ ｍｏｌ·L－１
ＨＡｃ５ µg·mＬ－１
ＮａＮＯ２水溶液０．４６７±0．０２２０．６５４±0．０３０５ µg·mＬ－１ ＮａＮＯ２ ＴＣＡ溶液０．３５４±0．０１６０．５１２±0．０２４隔离法０．５３８±0．０２００．７５２±0．０２６ＴＣＡ终止法
０．４０６±0．０１８
０．５８８±0．０２１
表中数据为重复３次的平均值±标准误。
３ 实验材料的取舍
由于不同实验材料中ＮＲ活性差别较大， 有的实验材料甚至检测不出ＮＲ活性， 因此在植物组织ＮＲ活性测定中， 选择合适的实验材料成为实验成功与否的关键。为了筛选出适合于ＮＲ活性测定的实验材料， 我们结合实验教学实际， 除了用上述３ ｍｏｌ·L－１ ＨＡｃ分别配制磺胺和α－萘胺２种显色剂，测定实验指导书中介绍的水培２周的水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ Ｌ．）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）、玉米（Ｚｅａｍａｙｓ Ｌ．）、豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）和烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）等几种植物叶片中的ＮＲ活性以外， 还以校园植物如法国梧桐（Ｐｌａｔａｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｌ．）、天
竺葵（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｈｏｒｔｏｒｕｍ Ｂａｉｌｅｙ）、向日葵（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）、蓖麻（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓＬ．）和蜀葵（Ａｌｔｈａｅａ ｒｏｓｅａ Ｌｉｎｎ．）等植物叶片为实验材料进行了ＮＲ活性的测定， 得到表３的结果。从表３可以看出， 实验指导书中介绍的几种实验材料的ＮＲ活性在４．５￣３２．６ µg·ｇ－１ （ＦＷ）·ｈ－１之间， 平均值为１４．７８ µg·ｇ－１ （ＦＷ）·ｈ－１， 而新测定的几种植物实验材料的ＮＲ活性在４４￣２０６．６ µg·ｇ－１ （ＦＷ）·ｈ－１之间，平均值为１２５ µg·ｇ－１ （ＦＷ）·ｈ－１， ＮＲ活性大约是前者的８．５倍， 表现出很高的ＮＲ活性。
表３ 几种实验材料中的ＮＲ活性比较
实验材料 酶活性／µg·ｇ－１ （ＦＷ）·ｈ－１实验指导书中的实验材料
水稻
１４．５±0．３小麦 ２６．１±1．０玉米 ５２．５±1．５豌豆 ３９．２±1．２烟草
１０５．６±4．３改进和新增加的实验材料
法国梧桐１４５．２±5．５天竺葵２６４．３±7．５向日葵３９０．６±1１．５蓖麻５７０．４±1２．１蜀葵
６８８．５±1５．２
表中植物叶片的取材时间为下午２点， 数据为重复３次的平均值±标准误。
综上所述， 在植物组织ＮＲ活性测定中， 我们
建议广大同行在选用合适的实验材料， 如向日葵、蓖麻和蜀葵等植物叶片， 尤其以蜀葵叶片为最佳的基础上， 以３ ｍｏｌ·L－１ ＨＡｃ为溶剂分别配制磺胺和α－萘胺两种显色剂， 不仅可以提高显色反应的灵敏度， 而且还可以加快显色反应的速度并缩短显色反应的时间， 达到事半功倍的效果， 对于实验指导书中用ＴＣＡ终止ＮＲ酶促反应的方法值得商榷。
参考文献
白宝璋， 汤学军（１９９３）． 植物生理学测试技术． 北京： 科学技术出
版社， ２４￣２５
郝建军， 康宗利， 于洋（２００７）． 植物生理学实验技术． 北京： 化学
工业出版社， ６２￣６４
李合生， 赵世杰， 张文华（２００１）． 植物生理生化实验原理和技术．
北京： 高等教育出版社， １２５￣１２８
张志良， 瞿伟菁（２００３）． 植物生理学实验指导（第３版）． 北京： 高
等教育出版社， ４２
植物生理学通讯 第４５卷 第１期，２００９年１月67
磺胺比色法测定植物组织硝酸还原酶活性的改进
李忠光＊， 龚明
云南师范大学生命科学学院， 昆明６５００９２
“植物组织硝酸还原酶（ＮＲ）活性的测定”是植
物生理学矿质营养一章中必做的实验， 其目的是让学生掌握植物硝酸还原酶（ｎｉｔｒａｔｅ ｒｅｄｕｃｔａｓｅ， ＮＲ， ＥＣ．１．６．６．１）活性测定的原理和技术方法， 进一步了解ＮＲ在植物氮素同化过程中的作用（白宝璋和汤学军１９９３； 李合生等２００１； 郝建军等２００７）。但是， 在实验教学中， 我们感到， 按照几种植物生理学实验指导书中介绍的方法（白宝璋和汤学军１９９３； 李合生等２００１； 郝建军等２００７）测定ＮＲ活性， 测得的ＮＲ活性很低， 有时甚至检测不出来。因此我们对此方法的显色液配方、显色时间、三氯乙酸对显色反应的影响和实验材料的取舍进行了探索， 取得了较好的实验效果。
１ 显色液配方和显色时间的确定
磺胺比色法测定植物组织ＮＲ活性的原理， 是根据ＮＲ还原ＮＯ－３后所产生的ＮＯ－２在酸性条件下首先与磺胺发生重氮化反应形成重氮盐， 后者再进一步与α－萘胺发生偶联反应形成粉红色的偶氮化合物， 通过测定偶氮化合物形成的量来表示硝酸还原酶活性的大小， 因此常用到磺胺和α－萘胺２种显色剂。但是， 我们在实验中发现， 按照实验指导书
中的方法用２５％ ＨＣｌ （Ｖ／Ｖ， 即３ ｍｏｌ·
L－１）分别配制磺胺和α－萘胺２种显色剂， 表现出溶解度小， 反应速度慢， 灵敏度低， 显色时间长（实验指导书中为３０ｍｉｎ）等缺点。在用磺胺比色法测定植物组织ＮＲ活性实验中， 酸度是影响重氮化反应和偶联反应的主要影响因素之一（张志良和瞿伟菁２００３）， 为了找出合适的显色液配方， 也就是合适的显色液酸度， 我
们除了用实验指导书中指定的配方， 即用３ ｍｏｌ·
L－１的ＨＣｌ分别配制磺胺和α－萘胺２种显色剂外， 还用
相同浓度的Ｈ２ＳＯ４、Ｈ３ＰＯ４和ＨＡｃ分别配制显色液，并在２５ ℃下测试它们分别与５ µg·mＬ－１ ＮａＮＯ２显色反应１５ ｍｉｎ和３０ ｍｉｎ的光密度Ａ５２０， 得到表１的结果。从表１可以看出， 随着酸强度的增加， ２个显色时间的Ａ５２０都呈现逐渐下降的趋势， 具体表现
为ＨＡｃ＞Ｈ－１３ＰＯ４＞ＨＣｌ＞Ｈ２ＳＯ４。此外， 以３ ｍｏｌ·L ＨＡｃ为溶剂配制的显色液与５ µg·mＬ－１ ＮａＮＯ２显色反应１５ ｍｉｎ， 其Ａ５２０即可达到最大值， 而其余３种需显色３０ ｍｉｎ， Ａ５２０才能达到最大值， 并且它们的Ａ５２０始终小于ＨＡｃ的， 说明用ＨＡｃ配制的显色液其显色反应速度和灵敏度都明显高于分别以Ｈ２ＳＯ４、ＨＣｌ和Ｈ３ＰＯ４为溶剂配制的。因此， 在植物组织ＮＲ活性
测定中， 以３ ｍｏｌ·
L－１ ＨＡｃ为溶剂配制磺胺和α－萘胺２种显色剂， 不仅可提高显色反应的灵敏度， 而且还可以加快显色反应的速度并缩短显色反应的时
表１ 几种配方的显色液对ＮＯ－２显色速度和灵敏度的影响
Ａ５２０
配方
显色１５ ｍｉｎ 显色３０ ｍｉｎ
实验指导书中的配方３ ｍｏｌ·L－１ ＨＣｌ０．２２８±0．０１１０．４６７±0．０２２改进和新增加的配方３ ｍｏｌ·L－１
Ｈ２ＳＯ４
０．１８２±0．００８０．４４８±0．０１７３ ｍｏｌ·L－１ Ｈ３ＰＯ４０．３２９±0．０１３０．５６１±0．０２５
３ ｍｏｌ·L－１ ＨＡｃ
０．６４８±0．０３１０．６５４±0．０３０
表中数据为重复３次的平均值±标准误。
间， 显色反应时间仅为１５ ｍｉｎ， 光密度Ａ５２０就可达到最大值， 达到事半功倍的效果。２ 三氯乙酸对显色反应的影响
在用活体法测定植物组织ＮＲ活性时， 植物生理学实验指导书中常用终浓度为３％ （１８４ ｍｍｏｌ·Ｌ－１）的三氯乙酸（ＴＣＡ）终止酶促反应（李合生等２００１）。我们在实验中用上述２种显色液（即以３ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ＨＣｌ或ＨＡｃ为溶剂分别配制磺胺和α－萘胺）在２５ ℃下分别测试了用蒸馏水或１８４ ｍｍｏｌ·Ｌ－１ ＴＣＡ配制的５ ｇ·ｍＬ－１ ＮａＮＯ２， 以及用ＴＣＡ终止酶促反应法
（ＴＣＡ终止法）测定蜀葵叶片中的ＮＲ活性（酶促反应
收稿２００８－１０－１９
修定
２００８－１１－１７
资助
云南师范大学综合性和设计性实验研究项目。
＊ Ｅ－ｍａｉｌ： ｚｈｏｎｇｇｕａｎｇ＿ｌｉ＠１６３．ｃｏｍ； Ｔｅｌ： ０８７１－５５１７３９４
68植物生理学通讯 第４５卷 第１期，２００９年１月
时间到后， 立即把被测液从含有实验材料的反应体系中取出的方法称为隔离法）， 显色３０ ｍｉｎ后分别测定其光密度Ａ５２０， 得到表２的结果。从表中可以看出， 与以蒸馏水为溶剂配制ＮａＮＯ２相比， 用ＴＣＡ配制（相当于用ＴＣＡ终止酶促反应）明显降低了Ａ５２０； 类似地， 用ＴＣＡ终止法所测出的Ａ５２０也明显低于隔离法。这些结果说明ＴＣＡ降低了磺胺比色法测定ＮＯ－２的灵敏度， 其原因可能是外加ＴＣＡ后导致反应体系的酸度变大， 从而影响重氮化反应和偶联反应的速度（张志良和瞿伟菁２００３； 表１）。这些结果表明在植物组织ＮＲ活性测定中， 用ＴＣＡ终止反应是不适合的， 否则测定结果将明显偏低， 实验指导书中用ＴＣＡ终止反应值得商榷。为了更准确地测定ＮＲ活性， 酶促反应结束后， 立即将所测液从含有实验材料的反应体系中取出（隔离法）， 从而使底物和ＮＲ分离， 仍可达到终止酶促反应的目的。
表２ ＴＣＡ对磺胺比色法测定ＮＲ活性显色反应的影响
Ａ５２０
测定内容和方法
３ ｍｏｌ·L－１
ＨＣｌ ３ ｍｏｌ·L－１
ＨＡｃ５ µg·mＬ－１
ＮａＮＯ２水溶液０．４６７±0．０２２０．６５４±0．０３０５ µg·mＬ－１ ＮａＮＯ２ ＴＣＡ溶液０．３５４±0．０１６０．５１２±0．０２４隔离法０．５３８±0．０２００．７５２±0．０２６ＴＣＡ终止法
０．４０６±0．０１８
０．５８８±0．０２１
表中数据为重复３次的平均值±标准误。
３ 实验材料的取舍
由于不同实验材料中ＮＲ活性差别较大， 有的实验材料甚至检测不出ＮＲ活性， 因此在植物组织ＮＲ活性测定中， 选择合适的实验材料成为实验成功与否的关键。为了筛选出适合于ＮＲ活性测定的实验材料， 我们结合实验教学实际， 除了用上述３ ｍｏｌ·L－１ ＨＡｃ分别配制磺胺和α－萘胺２种显色剂，测定实验指导书中介绍的水培２周的水稻（Ｏｒｙｚａｓａｔｉｖａ Ｌ．）、小麦（Ｔｒｉｔｉｃｕｍ ａｅｓｔｉｖｕｍ Ｌ．）、玉米（Ｚｅａｍａｙｓ Ｌ．）、豌豆（Ｐｉｓｕｍ ｓａｔｉｖｕｍ Ｌ．）和烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍ Ｌ．）等几种植物叶片中的ＮＲ活性以外， 还以校园植物如法国梧桐（Ｐｌａｔａｎｕｓ ｏｒｉｅｎｔａｌｉｓ Ｌ．）、天
竺葵（Ｐｅｌａｒｇｏｎｉｕｍ ｈｏｒｔｏｒｕｍ Ｂａｉｌｅｙ）、向日葵（Ｈｅｌｉａｎｔｈｕｓ ａｎｎｕｕｓ Ｌ．）、蓖麻（Ｒｉｃｉｎｕｓ ｃｏｍｍｕｎｉｓＬ．）和蜀葵（Ａｌｔｈａｅａ ｒｏｓｅａ Ｌｉｎｎ．）等植物叶片为实验材料进行了ＮＲ活性的测定， 得到表３的结果。从表３可以看出， 实验指导书中介绍的几种实验材料的ＮＲ活性在４．５￣３２．６ µg·ｇ－１ （ＦＷ）·ｈ－１之间， 平均值为１４．７８ µg·ｇ－１ （ＦＷ）·ｈ－１， 而新测定的几种植物实验材料的ＮＲ活性在４４￣２０６．６ µg·ｇ－１ （ＦＷ）·ｈ－１之间，平均值为１２５ µg·ｇ－１ （ＦＷ）·ｈ－１， ＮＲ活性大约是前者的８．５倍， 表现出很高的ＮＲ活性。
表３ 几种实验材料中的ＮＲ活性比较
实验材料 酶活性／µg·ｇ－１ （ＦＷ）·ｈ－１实验指导书中的实验材料
水稻
１４．５±0．３小麦 ２６．１±1．０玉米 ５２．５±1．５豌豆 ３９．２±1．２烟草
１０５．６±4．３改进和新增加的实验材料
法国梧桐１４５．２±5．５天竺葵２６４．３±7．５向日葵３９０．６±1１．５蓖麻５７０．４±1２．１蜀葵
６８８．５±1５．２
表中植物叶片的取材时间为下午２点， 数据为重复３次的平均值±标准误。
综上所述， 在植物组织ＮＲ活性测定中， 我们
建议广大同行在选用合适的实验材料， 如向日葵、蓖麻和蜀葵等植物叶片， 尤其以蜀葵叶片为最佳的基础上， 以３ ｍｏｌ·L－１ ＨＡｃ为溶剂分别配制磺胺和α－萘胺两种显色剂， 不仅可以提高显色反应的灵敏度， 而且还可以加快显色反应的速度并缩短显色反应的时间， 达到事半功倍的效果， 对于实验指导书中用ＴＣＡ终止ＮＲ酶促反应的方法值得商榷。
参考文献
白宝璋， 汤学军（１９９３）． 植物生理学测试技术． 北京： 科学技术出
版社， ２４￣２５
郝建军， 康宗利， 于洋（２００７）． 植物生理学实验技术． 北京： 化学
工业出版社， ６２￣６４
李合生， 赵世杰， 张文华（２００１）． 植物生理生化实验原理和技术．
北京： 高等教育出版社， １２５￣１２８
张志良， 瞿伟菁（２００３）． 植物生理学实验指导（第３版）． 北京： 高
等教育出版社， ４２