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・８８１・
．论著
Ｎｏｔｃｈ信号通路在慢性阻塞性肺疾病免疫失衡中的作用及机制研究
杨鑫娜
刘晓菊赵兰婷曾晓丽包海荣
【摘要】目的探讨Ｎｏｔｃｈ信号通路在慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）免疫失衡中的作用。方法
ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３０只按随机数字表法分为健康对照组、慢阻肺组及慢阻肺１分泌酶抑制剂（ＧＳＩ）组。烟草烟雾暴露法建立小鼠慢阻肺模型；尼龙毛柱提纯Ｔ淋巴细胞，流式细胞术检测Ｔ细胞亚群；实时荧光定量ＰＣＲ和蛋白印迹法检测Ｎｏｔｃｈｌ及其下游ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白。结果Ｔｈｌ／ＣＤ；Ｔ、Ｔｈｌ７／
ｃＤｆＴ和Ｔｒｅｇ／ＣＤ；Ｔ慢阻肺组为（１３．２０±０．９５，１０．２２±０．４５，０．４１±０．０９）较健康对照组（８．０７±０．４４，５．９８±０．２６，０．２６±０．０５）明显增加（均Ｐ＜０．０１）；ＧＳＩ降低Ｔｈｌ／ＣＤ；Ｔ和Ｔｈｌ７／ＣＤ４＋Ｔ；慢阻肺
组Ｔｈｌ／Ｔｈ２比值（１８．７０４－４．１２）较健康对照组（１２．６３±１．９１）明显升高（Ｐ＜ｏ．０１），慢阻肺组Ｔｈｌ７／
ＣＤ；Ｔ、Ｔｈｌ７／ＣＤ；Ｔ较健康对照组分别升高７１％、５８％，ＧＳＩ降低慢阻肺Ｔｈｌ／Ｔｈ２和Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ的比值
（均Ｐ＜０．０１）。慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ受体及下游ＨｅｓｌｍＲＮＡ（５．１５±０．７７，１．９２±０．３２）和蛋白（０．８５±０．０４，０．１６±０．０２）的表达较健康对照组（１．００±０．００，１．００±０．００）和（０．１７±０．０１，０．０９±０．０１）明显升高（均Ｐ＜０．０１），ＧＳＩ明显抑制慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达（均Ｐ＜０．０１）。相关性分析：慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ和ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达与Ｔｈｌ和Ｔｈｌ７细胞呈正相关，与ＴＩｌ２和Ｔｒｅｇ细胞呈负相关（均Ｐ＜０．０５）。结论慢阻肺小鼠存在Ｔ淋巴细胞亚群失衡，以Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７等促炎细胞增多为主；Ｎｏｔｃｈｌ及其下游ＨｅｓｌｍＲＮＡ及蛋白水平升高，且与Ｔ淋巴细胞亚群失衡相关；ＧＳＩ能部分抑制Ｎｏｔｃｈｌ、Ｈｅｓｌ的表达及Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７细胞；Ｎｏｔｃｈ信号通路参与慢阻肺的免疫紊乱。
【关键词】肺疾病，慢性阻塞性；受体，Ｎｏｔｅｈｌ；Ｔ淋巴细胞亚群；免疫失衡
基金项目：甘肃省科技支撑项目（１４４ＦＫＣＡ０６２）；兰州市科技计划项目（２０１４．１．３６）
ＥｆｆｅｃｔｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ
ｏｎ
ｉｉｎｎｌｌｍｅｉｍｂａｌａｎｔｅｉｎｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ
ｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ
ＹａｎｇＸｉｎｎａ，厶ｌｌ
Ｘｉａｏｊｕ，ＺｈａｏＬａｎｔｉｎｇ，ｚｅｎｇＸｉａｏｌｉ，ＢａｏＨａｉｒｏｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｒｏｎｔａｌＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅＦｉｒｓｔ
ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬｉｕＸｉａｏｊｕ，Ｅｎｔａｉｌ：ｌｉｕｘｉａｏｊｕ８３５＠１２６．ｃｏｒｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
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ｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＰＤ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｉｒｔｙＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙａｓｓｉｇｎｅｄ
ｉｎｔｏｔｈｅｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ＣＯＰＤｇｒｏｕｐ，ａｎｄＣＯＰＤＧａｍｍａｓｅｃｒｅｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＧＳＩ）ｇｒｏｕｐ．ＣｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅｅｘｐｏｓｕｒｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅＣＯＰＤｍｏｄｅｌ．Ｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｅｎｒｉｃｈｅｄｂｙｆｉｌｔｅｒｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈｎｙｌｏｎｗ００１ｃｏｌｕｍｎｓ．Ｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｓｐｌｅｅｎ－ｄｅｒｉｖｅｄＴ．１ｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｖ．Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ．ＰＣＲ）ａｎｄ
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ（ＷＢ）ｗｅｒｅｕｓｅｄ
ｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｐｌｅｎｉｃＴｃｅｌｌｓ’ＮｏｔｃｈｌａｎｄｉｔｓｄｏｗｎｓｔｒｅａｍＨｅｓｌ
ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
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ａｎｄ５８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＧＳＩｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｒａｔｉｏｓｏｆＴｈｌ／Ｔｈ２ａｎｄＴｈｌ７／Ｔｒｅｇ（ａｌｌＰ＜０．０１）．ＮｏｔｅｈｌｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｄｉｔｓｄｏｗｎｓｔｒｅａｍＨｅｓｌｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（５．１５±０．７７，１．９２±０．３２）ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
（０．８５±０．０４，０．１６±０．０２）ｏｆ
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ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔ１１ｅｈｅａｌｔｈｙｇｒｏｕｐ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ［（１．００±０．００，１．００±０．００）ａｎｄ（Ｏ．１７±０．０１，０．０９±０．０１）］（ａｌｌＰ＜０．０１）．ＧＳＩ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－０９３９．２０１６．１１．０１２
作者单位：７３００００兰州大学第一医院老年呼吸科通信作者：刘晓菊，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｘｉａｏｊｕ８３５＠１２６．ｃｏｍ
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ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｈｉｂｉｔｅｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｉｎＮｏｔｃｈｌａｎｄｉｔｓｄｏｗｎｓｔｒｅａｍＨｅｓｌ（ａＵＰ＜
０．０１）．ＮｏｔｃｈｌａｎｄＨｅｓｌｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｓ
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ＩｎＣＯＰＤ
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ｃｅｌｌｓ．ａｎｄｔｈｕｓＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｗａｓｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｔｈｅｉｍｍｕｎｅｄｉｓｏｒｄｅｒｏｆＣＯＰＤｍｉｃｅ．
【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ
Ｓｕｂｓｅｔｓ；Ｉｍｍｕｎｅｉｍｂａｌａｎｃｅ
ｄｉｓｅａｓｅ，ｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ；Ｒｅｃｅｐｔｏｒ，Ｎｏｔｃｈｌ；Ｔ—Ｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅ
Ｆｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｕｐｐｏａＰｒｏｇｒａｍｏｆＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ（１４４ＦＫＣＡ０６２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｇｒａｍｏｆＬａｎｚｈｏｕＣｉｔｙ（２０１４—１－３６）
慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）是以慢性气道炎症和持续气流受限为特征的常见气道疾病，其发病与肺部炎症反应、氧化应激、蛋白酶一抗蛋白酶失衡、自主神经功能失调等有关。近年来，研究发现慢阻肺的发生发展与免疫紊乱密切相关¨Ｊ。Ｎｏｔｃｈ信号是条高度保守的信号转导途径，在调控Ｔ淋巴细胞分化中发挥重要作用旧引。文献报道Ｎｏｔｃｈ信号通路参与哮喘等疾病的免疫失衡Ｈ引，但在慢阻肺中的作用鲜见报道。本研究以慢阻肺小鼠为研究对象，通过给予Ｎｏｔｃｈ信号通路特异性抑制剂１一分泌酶抑制剂（ＧＳＩ）阻断Ｎｏｔｃｈ信号通路，检测慢阻肺小鼠Ｔ细胞Ｎｏｔｃｈｌ受体及其下游分子Ｈｅｓｌ及Ｔ细胞亚群的比例，观察慢阻肺小鼠Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ的变化与Ｎｏｔｃｈ信号通路的关系，探讨慢阻肺免疫功能紊乱的发生机制，为防治慢阻肺奠定基础。
材料及方法
１．主要材料：兰州牌香烟（甘肃省烟草公司），藻红蛋白（ＰＥ）一花青燃料５（ＣＹ５）标记的抗小鼠ＣＤ４单克隆抗体、ＰＥ标记的抗小鼠白介素（ＩＬ）＿４单克隆抗体、ＰＥ标记的抗小鼠叉状头／翅膀状螺旋转录因子（Ｆｏｘｐ３）单克隆抗体、异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记的抗小鼠ＩＬ．１７Ａ单克隆抗体、ＦＩＴＣ标记的抗小鼠干扰素－＾ｙ（美国ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ公司），逆转录试剂盒和实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒（日本Ｔａｋａｒａ公司）。羊抗鼠Ｎｏｔｃｈｌ单克隆抗体（美国Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ
公司），兔抗鼠Ｈｅｓｌ单克隆抗体（英国Ａｂｃａｍ公司），ＧＳＩ（美国Ｓｉｇｍａ公司），ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭ型流式细胞仪（美国ＢＤ公司），ＢＩＯ－ＲＡＤ
ＣｈｅｍｉＤｏｃⅢＸＲＳ
凝胶成像系统（美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司），ＧＹＤ－００３型无创小鼠肺功能仪（法国Ｅｍｋａ公司）。
２．慢阻肺小鼠模型建立与实验分组：８周龄雄性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３０只，平均体重（２０±２）ｇ，购白兰州大学实验动物中心［批号ＳＣＸＫ（甘）２０１３－０００２＋］。
慢阻肺小鼠模型建立：采用单纯烟草烟雾暴露ｃｍ×３０ｃｍ×３５
ｃｍ有机玻璃箱
内，每１３暴露烟草烟雾４次（４支×４５ｍｉｎ），间
隔１ｈ，连续９０
ｄ∞。１。
分组：小鼠按随机数字表法分为３组：健康对照ｄ后，隔日腹腔注射ＧＳＩ（１ｍｇ／ｋｇ），共肺功能测定：造模结束后，采用小鼠无创肺功能ｍｉｎ，检测吸气峰流速（ＰＩＦ）、呼气峰流速（ＰＥＦ）和呼出５０％潮气量时的呼气流速（ＥＦＳ０）¨。。
肺组织病理标本采集、染色及测定：造模结束的计数，每只小鼠取３个肺组织病理切片，中倍镜下随机取５个视野（避开大血管和支气管），在每个视野正中心划十字交叉线，计数与交叉线相交的肺泡隔数（ＮＳ），同时测出十字线总长（Ｌ），按公式计算：ＭＬＩ＝Ｌ／ＮＳ，以表示肺泡平均内径归Ｊ。
３．脾脏淋巴细胞分离及Ｔ淋巴细胞提纯：无菌取小鼠脾脏，２００目滤网研磨过滤，调整细胞数１×１０８／ｍｌ，加于淋巴细胞分离液上，２５００转／ｍｉｎ，
ｍｉｎ，离心半径：１０ｃｍ，吸取中间层淋巴细胞，磷
酸盐缓冲液洗２次，ＲＰＭＩ．１６４０调整细胞数２×１０７／ｍｌ，尼龙毛柱过滤提纯Ｔ细胞¨１。，调整细胞数为２×１０６／ｍｌ，加入ＦＩＴＣ标记ＣＤ，抗体，流式细胞仪测定总Ｔ（ＣＤ；Ｔ）细胞。
４．ＣＤ４Ｔ淋巴细胞（ＣＤ；Ｔ）亚群检测：参照
Ｚｈａｎｇ等【ｌ纠方法，ＲＰＭＩ一１６４０调整脾淋巴细胞悬液细胞数２×１０６／ｍｌ，接种到２４孔板，加入佛波酯／离子霉素混合物和布雷菲德菌素／莫能菌素混合物，
５％ＣＯ，、３７
ｏＣ培养８ｈ，调整细胞数１×１０６／ｍｌ，加
入ＰＥ／ＣＹ５标记ＣＩＭ抗体，室温避光孵育２０ｍｉｎ；
法，将小鼠置于５０
组、慢阻肺组及慢阻肺ＧＳＩ组。慢阻肺ＧＳＩ组小鼠烟草烟雾暴露６１计１５次，其余两组注射等体积无菌双蒸水¨引。
检测系统检测小鼠肺功能，将小鼠置于体描箱内，在清醒和自由活动状态下适应５后，处死小鼠，取肺组织，４％多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，苏木素伊红（ＨＥ）染色，酒精脱水、烘干，中性树胶封片，进行肺组织切片肺泡平均间隔（ＭＬＩ）２０
虫垡缱拯塑哩噬盘查呈！！鱼生！！旦箜塑鲞箜！！翅ｇｂ也』旦！！望堕！！Ｐ堡旦堡：堕！！！堂竺！！！！：ｙ！！：！！：盟！：！１
４％多聚甲醛４℃固定１０ｍｉｎ后破膜，分别加入ＰＥ标记ＩＬ－４和ＦＩＴＣ标记干扰素－Ｙ、ＰＥ标记Ｆｏｘｐ３和ＦＩＴＣ标记ＩＬ．１７Ａ，室温避光孵育２０ｍｉｎ，流式细胞仪检测ＣＤ４Ｔ的Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ细胞比例。
５．实时荧光定量ＰＣＲ法检测Ｎｏｔｃｈｌ和Ｈｅｓｌ
０．０１，表１）。肺组织病理切片镜下可见慢阻肺组终末细支气管远端气腔膨胀，间隔变窄，弹力纤维变细或断裂，部分肺泡腔扩大、肺泡壁破裂，融合形成肺大疱，肺泡数目明显减少，肺泡间隔可见炎症细胞浸润，ＭＬＩ较健康对照组、慢阻肺ＧＳＩ组明显增加（均Ｐ＜０．０１），慢阻肺ＧＳＩ组小鼠炎症细胞浸润及肺气肿程度较慢阻肺组小鼠轻，健康对照组肺泡组织结构基本完整无异常。
２．Ｔ细胞鉴定：通过流式细胞仪检测总Ｔ细胞阳性率百分比为（８１．７６－４－１．５３）％。
３．ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７、Ｔｒｅｇ及其比值：慢阻肺组较健康对照组Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７、Ｔｒｅｇ
ＣＤ４＋Ｔ
ｍＲＮＡ：提取总ＲＮＡ，逆转录试剂盒合成ｃＤＮＡ。引物：Ｎｏｔｃｈｌ上游：５
３７，下游：５
７．ＴＧＣＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＧＡＧ．
７一ＧＧＴＣＣＣＴＧＴＧＴＡＡＣＣＴＴＣＴＧＴ一３’，扩增
７一ＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴＣＴ
长度１１１ｂｐ；Ｈｅｓｌ上游：５
ＴＣＴＧＡＣ．３
７，下游：５’一ＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＣＡＡＴＡＴＧＡＡＣ一
３’，扩增长度１８７ｂｐ；１３一ａｃｔｉｎ上游：５’一ＣＣＴＣＴＡＴＧＣ
ＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＣ．３’，
下游：
５’一ＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＦ
及Ｔｈｌ／Ｔｈ２比值均明显高于健康对照组，Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ无明显差异；慢阻肺组Ｔｈｌ７／ＣＤ；Ｔ、Ｔｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔ较健康对照组分别升高７１％、５８％；ＧＳＩ能明显降低慢阻肺组Ｔｈｌ／ＣＤ４＋Ｔ、Ｔｈｌ７／ＣＤ４＋Ｔ及Ｔｈｌ／Ｔｈ２和Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ的比值，均Ｐ＜０．０１，ＧＳＩ降低慢阻肺组
Ｔｈｌ７／ＣＤ；Ｔ
ＧＣＴＧＡＴＣＣ．３’，扩增长度２１１ｂｐ；反应体系２０汕ｌ，扩
增条件：９５℃预变性３０
０．５
Ｓ，９５
ｏＣ变性５
ｓ，６０
ｏＣ退火
延伸３４Ｓ，共４０个循环，溶解６５～９５℃，每５Ｓ上升
ｏＣ；基因表达采用２“们‘法。
６．Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法检测Ｎｏｔｃｈｌ和Ｈｅｓｌ蛋白：提２５％，升高Ｔｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔ１０％（表２）。
取总蛋白测定蛋白含量，取５０¨ｇ蛋白样品，１０％十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏氟乙烯膜，５％脱脂奶粉室温封闭２ｈ，羊抗鼠Ｎｏｔｃｈｌ多克隆抗体（１：２００）、兔抗鼠Ｈｅｓｌ多克隆抗体
（１：７５００）及内参照物兔抗鼠甘油醛一３．磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）（１：２００）４ｏＣ过夜，兔抗羊ＩｇＧ（１：２０００）、
４．Ｔ淋巴细胞Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达：慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白较健康对照组明显增加（均Ｐ＜０．０１），ＧＳＩ明显抑制慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达，均Ｐ＜Ｏ．０１（表３）。
５．相关性分析：慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ和ＨｅｓｌｍＲＮＡ、蛋白的表达与Ｔｈｌ／ＣＤ４＋Ｔ、Ｔｈｌ７／ＣＤ４＋Ｔ细胞比例呈正相关，与Ｔｈ２／ＣＤ，＋Ｔ、Ｔｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔ细胞比例呈负相关（表４）。
讨
论
羊抗兔ＩｇＧ（１：２０００）室温２ｈ，显影，检测蛋白条带。蛋白相对表达为目的基因灰度值／内参基因灰度值。
７．统计学处理：采用ＳＰＳＳ２１．０软件进行统计学分析，计量资料数据以元±ｓ表示，组间比较采用单因素方差分析和ＬＳＤ—ｔ检验，Ｐｅａｒｓｏｎ法进行相关性分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结
果
慢阻肺的发生发展与免疫紊乱密切相关，研究发现慢阻肺患者存在Ｔｈｌ／Ｔｈ２失衡，且以Ｔｈｌ型细胞增多为主¨Ｊ。慢阻肺小鼠肺内Ｔｈｌ细胞的增多产生干扰素一＾ｙ，促进炎性细胞肺内积聚，破坏肺脏结构的完整性¨３Ｉ。新近研究发现Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ细胞也参与慢阻肺的发病，Ｔｈｌ７细胞主要分泌ＩＬ一１７Ａ、
１．慢阻肺模型：慢阻肺组肺功能ＰＩＦ、ＰＥＦ和ＥＦ５０明显低于健康对照组和慢阻肺ＧＳＩ组（均Ｐ＜
表１健康对照组、慢阻肺组小鼠肺功能的比较（面±ｓ）
注：ＰＩＦ：吸气峰流速；ＰＥＦ：呼气峰流速；ＥＦ５０：呼出５０％潮气量时的呼气流速；ＭＬＩ：平均肺泡间隔；８Ｐ＜０．０１为与健康对照组比较；“Ｐ＜０．０１为与慢阻肺组比较
主堡结蕉塑哩哩苤查呈！！！生！！旦筮！！鲞筮！！翅曼！也』旦！！翌曼塑巳堡旦亟堕！！！里！竺！Ｑ！！：ｙ！！：塑：盟！：！！表２各组小鼠脾源性Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ和Ｔｈｌ７细胞比例的比较（面±ｓ）
注：与健康对照组比较，８ｔ值为３．０３～２５．７９，均Ｐ＜０．Ｏｌ；与慢阻肺组比较，“ｔ值为３．３１～１３．２９，均Ｐ＜Ｏ．０１
表３各组Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达结果比较（面±Ｓ，Ａ）
注：ｍＲＮＡ：２—６△Ｑ值；蛋白：目的基因灰度值／内参基因灰度值；与健康对照组相比，８ｔ值为１０．３４～４９．１９，均Ｐ＜０．０１；与慢阻肺组相比，“ｔ值为５．７２～１８．７５，均Ｐ＜０．０１
表４慢阻肺组各数据相关性分析
Ｔｒｅｇ细胞高，表明慢阻肺小鼠除存在Ｔｈｌ／Ｔｈ２失衡外，仍以Ｔｈｌ７细胞增加为主，而具有免疫抑制的Ｔｒｅｇ细胞增加不足，致免疫失控，肺组织炎性损伤持续。
Ｎｏｔｃｈ信号通路通过细胞间的相互作用，参与Ｔ细胞的活化、增殖和分化，进而在多种疾病的免疫失
注：ｍＲＮＡ：２一她ａ值；蛋白：目的基因灰度值／内参基因灰度值；８Ｐ＜０．Ｏｌ，６Ｐ＜０．０５
衡中起重要作用。各种成熟的免疫细胞和抗原提呈细胞等表面都有Ｎｏｔｃｈ受体和配体的表达，Ｎｏｔｃｈ是一种单次跨膜受体蛋白，哺乳动物体内有４种同源的Ｎｏｔｃｈ受体，即Ｎｏｔｃｈｌ／２／３／４，同时还有５种同源配体即Ｊａｇｇｅｄｌ／２、Ｄｅｌｔａｌ／３／４，通过细胞间的相互接触及１一分泌酶酶解后，活化下游靶基因Ｈｅｓ和Ｈｅｙ家族，共同参与Ｔ细胞的活化、增殖和分化，尤其在Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７及Ｔｒｅｇ等细胞分化中作用显
ＩＬ－６等加重慢阻肺气道炎症，分化成熟的Ｔｈｌ７细胞促使小鼠气道高表达ＣＣＲ６趋化因子受体，趋化中性粒细胞进人肺组织释放中性粒细胞弹力蛋白酶破坏肺组织，加剧气道炎症及肺气肿ｏ１４］。Ｔｒｅｇ细胞是调节性Ｔ细胞，是ＣＤ４Ｔ细胞中有免疫抑制和免疫调节效应的亚群，它可以通过细胞间的直接接触或分泌ＩＬ－１０和转换生长因子（ＴＧＦ）一Ｂ减轻过度的免疫应答，在慢性炎症和自身免疫疾病中起重要作用。
Ｅｐｐｅｒｔ等。１３。发现慢性香烟暴露增加小鼠肺脏Ｔｈｌ
著‘３川８。。Ｙｕ等‘１９１发现Ｎｏｔｃｈ信号通路抑制剂ＧＳＩ
可使Ｎｏｔｃｈ信号通路失活，使特发性血小板减少性紫癜患者Ｔｈｌ７细胞及Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ比值显著下降致免疫失衡。Ｚｈａｎｇ等㈣ｏ发现ＧＳＩ可减轻卵清蛋白诱导的哮喘的进展，抑制脾脏Ｔｈｌ７反应、降低血清ＩＬ一１７，抑制气道炎症和减轻临床症状，说明ＧＳＩ抑制Ｎｏｔｃｈ信号通路调节Ｔｈｌ７。ＧＳＩ可使过敏性哮喘小鼠肺泡灌洗液Ｔｈ２向Ｔｈｌ的漂移，这种表型的改变与炎性细胞Ｎｏｔｃｈ信号相关分子，如ＧＡＴＡ－３、Ｈｅｓｌ和Ｎｏｔｃｈ胞内段的变化一致，表明Ｎｏｔｃｈ信号通路参与过敏性哮喘的免疫失衡¨０｜。“等心川发现，慢性香烟烟雾暴露小鼠其气管旁淋巴结所有Ｎｏｔｃｈ受体和配体的表达均增高，尤以Ｎｏｔｃｈ３和Ｄｅｈａｌ的增高
和Ｔｈｌ７细胞，而Ｔｈ２细胞无明显变化。慢阻肺患者痰中Ｔｒｅｇ和Ｔｈｌ７细胞均增加【ｌ５｜，稳定期和急性加重慢阻肺患者外周血中Ｔｒｅｇ细胞的比例明显升高，而Ｔｒｅｇ／ＩＬ一１７比值无明显变化¨６Ｉ。本研究结果显示慢阻肺小鼠Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ细胞分别较健康对照组升高６４％、７１％、５８％，Ｔｈ２细胞无明显改变，Ｔｈｌ／Ｔｈ２的比值明显增加，而Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ的比值变化不大，考虑慢阻肺小鼠Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ细胞比例较健康对照小鼠均增加，但Ｔｈｌ７细胞增加的幅度较
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・８８５・
明显，这和小鼠肺气肿样形态学变化和Ｔｈｌ占优势的炎症一致。本研究结果表明，ＧＳＩ明显抑制慢阻肺组小鼠Ｔｈｌ和Ｔｈｌ７细胞，降低Ｔｈｌ／Ｔｈ２和Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ的比值，说明ＧＳＩ阻断Ｎｏｔｃｈ信号通路减少促炎的Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７细胞，改善Ｔｈｌ／Ｔｈ２、Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ比例，表明Ｎｏｔｃｈ信号通路可能部分参与调控慢阻肺小鼠Ｔｈｌ／Ｔｈ２、Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ免疫失衡。研究还发现慢阻肺小鼠脾源性Ｔ细胞Ｎｏｔｃｈｌ及其下游ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达明显升高，且Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达与Ｔｈｌ／ＣＤ；和Ｔｈｌ７／ＣＤ４＋细胞呈正相关，与Ｔｈ２／ＣＤ；和Ｔｒｅｇ／．ＣＤ４＋细胞比例呈负相关，ＧＳＩ能部分抑制Ｎｏｔｃｈｌ、Ｈｅｓｌ的表达和Ｔｈｌ及Ｔｈｌ７细胞，表明Ｎｏｔｃｈｌ、Ｈｅｓｌ的高表达与Ｔｈｌ和Ｔｈ７细胞增加有关，与Ｔｈ２和Ｔｒｅｇ细胞降低有关，Ｔｈｌ７信号通路可能通过调节Ｔｈｌ／Ｔｈ２、Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ失衡参与慢阻肺的免疫紊乱。
总之，慢阻肺小鼠存在Ｔ细胞亚群失衡，以Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７等促炎细胞增多为主；Ｎｏｔｃｈｌ及其下游
Ｈｅｓｌ
ｍＲＮＡ及蛋白水平升高，且与Ｔ淋巴细胞亚群
失衡相关；ＧＳＩ能部分抑制Ｎｏｔｃｈｌ、Ｈｅｓｌ的表达及Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７细胞；Ｎｏｔｃｈ信号通路参与慢阻肺的免疫紊乱。
参考文献
ｌ】ＢｒｕｓｓｅｌｌｅＧＧ，Ｊｏｏｓ
ＧＦ，Ｂｒａｃｋｅ
ＫＲ．Ｎｅｗ
ｉｎｓｉｇｈｔｓ
ｉｎｔｏ
ｔｈｅ
ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｏｆｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙ
ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，
２０ｌｌ，３７８（９７９５）：１０１５－１０２６．ＤＯＩ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（１１）
６０９８８４．２
ＤｅＯｂａｌｄｉａ
ＭＥ，ＢｈａｎｄｏｏｌａＡ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｎａｔｅ
ａｎｄａｄａｐｔｉｖｅｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｌｉｎｅａｇｅｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ
ＲｅｖＩｍｍｎｎｏｌ，２０１５，
３３：６０７拼２．ＤＯＩ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ—ｉｍｍｕｎｏｌ－０３２４１４—１１２０３２．
３］Ｒａｄｔｋｅ
Ｆ，ＭａｃＤｏｎａｉｄ
ＨＲ，Ｔａｃｃｈｉｎｉ—Ｃｏｔｔｉｅｒ
Ｆ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ
ｉｎｎａｔｅａｎｄａｄａｐｔｉｖｅ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ
ｂｙ
Ｎｏｔｃｈ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，
２０１３，１３（６）：４２７－４３７．ＤＯＩ：ｌＯ．１０３８／ｎ＾３４４５．
［４］ＫａｎｇＪＨ，Ｋｉｍ
ＢＳ，ＵｈｍＴＧ，ｅｔ
ａ１．Ｇａｍｍａ—ｓｅｃｒｅｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｒｅｄｕｃｅｓａｌｌｅｒｇｉｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ
ｂｙ
ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇＴｈｌａｎｄ
Ｔｈ２
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅ
Ｍｅｄ，２００９，１７９（１０）：
８７５－８８２．ＤＯＩ：１０．１１６４／ｒｃｅｍ．２００８０６－８９３０Ｃ．
［５］Ｇｕｗ，ｘｕＷ，Ｄｉｎｇ
Ｔ，ｅｔａ１．ＦｒｉｎｇｅｃｏｎｔｒｏｌｓｎａｉｖｅｃＤ４（＋）Ｔ
ｃｅｌｌｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｔｈｒｏｕｇｈ
ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ
ｎｏｔｃｈ
ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
ｉｎ
ａｓｔｈｍａｔｉｃ
ｒａｔ
ｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．ＰＬｏｓＯｎｅ，２０１２，７（１０）：ｅ４７２８８．ＤＯＩ：
ｌＯ．１３７ｌ／ｉｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４７２８８．
６
Ｌｉ
Ｌ，Ｂａｏ
Ｈ，Ｗｕ
Ｊ，ｅｔ
ａ１．Ｂａｉｃａｌｉｎ
ｉｓ
ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ｉｎ
ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅ—ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ｍｏｄｅｌｓｉｎｖｉｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏ：
Ａｐｏｓｓｉｂｌｅ
ｒｏｌｅ
ｆｏｒＨＤＡＣ２
ａｃｔｉｖｉｔｙ
ＪＩ．ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，
２０１２，１３（１）：１５－２２．ＤＯｌ：１０．１０１６／ｊ．ｉｎｔｉｍｐ．２０１２．０３．００１．
［７］邱敬满，刘晓菊，褚旭，等．黄芪多糖对ＰＭ２．５致慢性阻塞
性肺疾病肺泡巨噬细胞吞噬功能下降的保护机制［Ｊ］．中华结核和呼吸杂志，２０１６，３９（２）：１４４—１４７．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．
ｉｓｓｎ．１００１．０９３９．２０１６．０２．０１８．
［８］
ＧｌａａｂＴ，ＴａｕｂｅＣ．ＢｒａｕｎＡ，ｅｔａ１．Ｉｎｖａｓｉｖｅａｎｄｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ
ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｐｕｌｍｏｎａｒｙｆｕｎｃｔｉｏｎ
ｉｎ
ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｒｅｓｐｉｒ
Ｒｅｓ，
２００７，８：６３．ＤＯＩ：１０．１１８６／１４６５－９９２１－８－６３．
［９］
ＴａｎａｋａＫ，ＫｕｒｏｔｓｕＳ，ＡｓａｎｏＴ，ｅｔａ１．Ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙ
ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ
ｍｅｐｅｎｚｏｌａｔｅ
ｂｒｏｍｉｄｅ
ｏｖｅｒ
ｏｔｈｅｒ
ｒｏｕｔｅｓ
ａｓ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ｓｃｉ
Ｒｅｐ，
２０１４，４：４５１０．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０４５１０．
［１０］
Ｍｉｙａｍｏｔｏ
Ｓ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ
Ｍ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ
ＤＷ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｌｏｎ
ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙ
ｔａｒｇｅｔｉｎｇＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，
２０１３，３４（１０）：２４１５－２４２３．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｃａｒｃｉｎ／ｂｇｔｌ９１．ＷｏｈｌｅｒＪＥ．Ｂａｒｎｕｍ
ＳＲ．
Ｎｙｌｏｎ
ｗｏｏｌ
ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｌｔｅｒｓ
ｔｈｅ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＴ
ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＭｏｌＩｒｏｍｕｎｏｌ，２００９，４６（５）：１００７－１０１０．
ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２００８．０９．０１７．
［１２］
Ｚｈａｎｇ
ＭＱ，ＷａｎＹ，ＪｉｎＹ，ｅｔａ１．Ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｉｎｇｐｒｏｍｏｔｅｓ
ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＣＯＰＤｂｙａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ
ａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌ
ｏｆ
Ｔｈ／Ｔｒｅｇｓｔｈｍｕｇｈｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆｍｕｓｅａｒｉｎｉｅ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ３
ａｎｄ
５
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１４，９（１１）：
ｅ１１２３５０．ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１２３５０．
［１３］
Ｅｐｐｅｒｔ
ＢＬ，Ｗｏｒｔｈａｍ
ＢＷ，Ｆｌｕｒｙ
ＪＬ，ｅｔ
ａ１．Ｆｕｎｅｔｉｏｎａｌ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｉｎ
ａ
ｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｃｈｒｏｎｉｃ
ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙ
ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２０１３，１９０（３）：
１３３１—１３４０．ＤＯＩ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎ０１．１２０２４４２．
［１４］
ＭｉｏｓｓｅｃＰ，ＫｏｒｎＴ，ＫｕｃｈｒｏｏＶＫ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１７
ａｎｄｔｙｐｅ
１７
ｈｅｌｐｅｒＴ
ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，２００９，３６１（９）：８８８－８９８．ＤＯＩ：
１０．１０５６／ＮＥＪＭｒ扣７０７４４９．
［１５］
ＬｉＨ，Ｌｉｕ
Ｑ，Ｊｉａｎｇ
Ｙ，ｅｔ
ａ１．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｔｈｌ７／ｔｒｅｇｂａｌａｎｃｅｉｎ
ｔｈｅｓｐｕｔｕｍｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ
［Ｊ］．ＡｍＪ
Ｍｅｄ
Ｓｃｉ，２０１５，３４９（５）：３９２－３９７．ＤＯＩ：１０．１０９７／
ＭＡＪ．０｜Ｄ０００００００１００００４｛７．
［１６］
ＪｉｎＹ。ＷａｎＹ，ＣｈｅｎＧ，ｅｔａ１．Ｔｒｅｓ／ＩＬ一１７
ｒａｔｉｏ
ａｎｄＴｒｅｇ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎ
ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ
ＣＯＰＤ［Ｊ】．ＰＬｏＳ
Ｏｎｅ，２０１４，９
（１０）：ｅ１１１０４４．ＤＯＩ：１０．１３７ｌ／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１１０４４．
［１７］
ＡｍｓｅｎＤ，ＨｅｌｂｉｇＣ，ＢａｃｋｅｒＲＡ．ＮｏｔｃｈｉｎＴＣｅｌｌＤｉｆｉｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ＡｌｌＴｈｉｎｇｓ
Ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ，２０１５，３６（１２）：８０２・
８１４．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｉｔ．２０１５．１０．００７．［１８］
ＩｔｏＴ，ＣｏｎｎｅｔｔＪｉ．ＫｕｎｋｅｌＳＬ，ｅｔａ１．Ｎｏｔｃｈｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｅｌｉｎｋａｇｅ
ｏｆｉｎｎａｔｅ
ａｎｄａｄａｐｔｉｖｅ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．ＪＬｅｕｋｏｅＢｉｏｌ，２０１２，９２
（１）：５９－６５．ＤＯＩ：１０．１１８９／ｊｌｂ．１０１１５２９．
［１９］
Ｙｕ
Ｓ，ＬｉｕＣ，ＬｉＬ，ｅｔａ１．ＩｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｒｅｖｅｒｓｅｓ
ｔｈｅＴｈｌ７／Ｔｒｅｇ
ｉｍｂａｌａｎｃｅ
ｉｎ
ｃｅｌｌｓｆｒｏｍ
ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ
ｉｍｍｕｎｅ
ｔｈｒｏｍｂｏｅｙｔｏｐｅｎｉａ［Ｊ］．ＬａｂＩｎｖｅｓｔ，２０１５，９５（２）：１５７—１６７．ＤＯＩ：
１０．１０３８／ｌａｂｉｎｖｅｓｔ．２０１４．１４２．
Ｚｈａｎｇ
Ｗ，Ｚｈａｎｇ
Ｘ，ＳｈｅｎｇＡ，ｅｔａ１．１／－ＳｅｅｒｅｔａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ
ＡｌｌｅｖｉａｔｅｓＡｃｕｔｅＡｉｒｗａｙＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ
ｏｆＡｌｌｅｒｇｉｃ
ＡｓｔｈｍａｉｎＭｉｃｅ
ｂｙ
Ｄｏｗｎｒｅｇｎｌａｔｉｎｇ
Ｔｈｌ７Ｃｅｌｌ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
Ｊ１．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ
Ｉｎｆｌａｍｍ．２０１５．２０１５：２５８１６８．ＤＯＩ：１０．１
１５５／２０１５／２５８１６８．
ＬｉＳ，Ｈｕ
Ｘ，ＷａｎｇＺ，ｅｔａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｎｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇ
ｉｎ
ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｐｕｌｍｏｎａｒｙｅｍｐｈｙｓｅｍａａｎｄｂｌｅｏｍｙｃｉｎ－－
ｉｎｄｕｃｅｄｐｕｌｍｏｎａｒｙｆｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．ＩｎｆｌａｍｍＲｅｓ，２０１５，６４（５）：３６３－
３７１．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ０００１１．０１５旬８１６一Ｙ．
（收稿日期：２０１６－０３－０４）
（本文编辑：蔡蜀菁）
［２０］
［２１］
主堡笙夔塑壁哩盘查！Ｑ！！生！！旦箜！！鲞筮！！翅垦塾也』坠照堡曼塑Ｐｉ！旦堡：堕！！！堂竺垫！！：！！！：塑：型堡！！
・８８１・
．论著
Ｎｏｔｃｈ信号通路在慢性阻塞性肺疾病免疫失衡中的作用及机制研究
杨鑫娜
刘晓菊赵兰婷曾晓丽包海荣
【摘要】目的探讨Ｎｏｔｃｈ信号通路在慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）免疫失衡中的作用。方法
ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３０只按随机数字表法分为健康对照组、慢阻肺组及慢阻肺１分泌酶抑制剂（ＧＳＩ）组。烟草烟雾暴露法建立小鼠慢阻肺模型；尼龙毛柱提纯Ｔ淋巴细胞，流式细胞术检测Ｔ细胞亚群；实时荧光定量ＰＣＲ和蛋白印迹法检测Ｎｏｔｃｈｌ及其下游ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白。结果Ｔｈｌ／ＣＤ；Ｔ、Ｔｈｌ７／
ｃＤｆＴ和Ｔｒｅｇ／ＣＤ；Ｔ慢阻肺组为（１３．２０±０．９５，１０．２２±０．４５，０．４１±０．０９）较健康对照组（８．０７±０．４４，５．９８±０．２６，０．２６±０．０５）明显增加（均Ｐ＜０．０１）；ＧＳＩ降低Ｔｈｌ／ＣＤ；Ｔ和Ｔｈｌ７／ＣＤ４＋Ｔ；慢阻肺
组Ｔｈｌ／Ｔｈ２比值（１８．７０４－４．１２）较健康对照组（１２．６３±１．９１）明显升高（Ｐ＜ｏ．０１），慢阻肺组Ｔｈｌ７／
ＣＤ；Ｔ、Ｔｈｌ７／ＣＤ；Ｔ较健康对照组分别升高７１％、５８％，ＧＳＩ降低慢阻肺Ｔｈｌ／Ｔｈ２和Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ的比值
（均Ｐ＜０．０１）。慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ受体及下游ＨｅｓｌｍＲＮＡ（５．１５±０．７７，１．９２±０．３２）和蛋白（０．８５±０．０４，０．１６±０．０２）的表达较健康对照组（１．００±０．００，１．００±０．００）和（０．１７±０．０１，０．０９±０．０１）明显升高（均Ｐ＜０．０１），ＧＳＩ明显抑制慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达（均Ｐ＜０．０１）。相关性分析：慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ和ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达与Ｔｈｌ和Ｔｈｌ７细胞呈正相关，与ＴＩｌ２和Ｔｒｅｇ细胞呈负相关（均Ｐ＜０．０５）。结论慢阻肺小鼠存在Ｔ淋巴细胞亚群失衡，以Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７等促炎细胞增多为主；Ｎｏｔｃｈｌ及其下游ＨｅｓｌｍＲＮＡ及蛋白水平升高，且与Ｔ淋巴细胞亚群失衡相关；ＧＳＩ能部分抑制Ｎｏｔｃｈｌ、Ｈｅｓｌ的表达及Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７细胞；Ｎｏｔｃｈ信号通路参与慢阻肺的免疫紊乱。
【关键词】肺疾病，慢性阻塞性；受体，Ｎｏｔｅｈｌ；Ｔ淋巴细胞亚群；免疫失衡
基金项目：甘肃省科技支撑项目（１４４ＦＫＣＡ０６２）；兰州市科技计划项目（２０１４．１．３６）
ＥｆｆｅｃｔｓａｎｄｍｅｃｈａｎｉｓｍｓｏｆＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙ
ｏｎ
ｉｉｎｎｌｌｍｅｉｍｂａｌａｎｔｅｉｎｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅ
ｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ
ＹａｎｇＸｉｎｎａ，厶ｌｌ
Ｘｉａｏｊｕ，ＺｈａｏＬａｎｔｉｎｇ，ｚｅｎｇＸｉａｏｌｉ，ＢａｏＨａｉｒｏｎｇ．ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＧｅｒｏｎｔａｌＲｅｓｐｉｒａｔｏｒｙＭｅｄｉｃｉｎｅ，ｔｈｅＦｉｒｓｔ
ＨｏｓｐｉｔａｌｏｆＬａｎｚｈｏｕＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，Ｌａｎｚｈｏｕ７３００００，Ｃｈｉｎａ
Ｃｏｒｒｅｓｐｏｎｄｉｎｇａｕｔｈｏｒ：ＬｉｕＸｉａｏｊｕ，Ｅｎｔａｉｌ：ｌｉｕｘｉａｏｊｕ８３５＠１２６．ｃｏｒｎ
【Ａｂｓｔｒａｃｔ】
Ｏｂｊｅｃｔｉｖｅ
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ｅｘｐｌｏｒｅ
ｔｈｅｒｏｌｅｏｆＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙｏｎｉｍｍｕｎｅｉｍｂａｌａｎｃｅｉｎ
ｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ（ＣＯＰＤ）．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｉｒｔｙＢＡＬＢ／ｃｍｉｃｅｗｅｒｅｒａｎｄｏｍｌｙａｓｓｉｇｎｅｄ
ｉｎｔｏｔｈｅｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ，ＣＯＰＤｇｒｏｕｐ，ａｎｄＣＯＰＤＧａｍｍａｓｅｃｒｅｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ（ＧＳＩ）ｇｒｏｕｐ．ＣｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅｅｘｐｏｓｕｒｅｗａｓｕｓｅｄｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈｔｈｅＣＯＰＤｍｏｄｅｌ．Ｔｃｅｌｌｓｗｅｒｅｅｎｒｉｃｈｅｄｂｙｆｉｌｔｅｒｉｎｇｔｈｒｏｕｇｈｎｙｌｏｎｗ００１ｃｏｌｕｍｎｓ．Ｔｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆｓｐｌｅｅｎ－ｄｅｒｉｖｅｄＴ．１ｙｍｐｈｏｃｙｔｅｓｕｂｓｅｔｓｗａｓｄｅｔｅｃｔｅｄｂｙｆｌｏｗｃｙｔｏｍｅｔｒｖ．Ｒｅａｌ．ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｐｏｌｙｍｅｒａｓｅｃｈａｉｎ
ｒｅａｃｔｉｏｎ（ＲＴ．ＰＣＲ）ａｎｄ
Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ（ＷＢ）ｗｅｒｅｕｓｅｄ
ｔｏｄｅｔｅｃｔｔｈｅ
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｓｐｌｅｎｉｃＴｃｅｌｌｓ’ＮｏｔｃｈｌａｎｄｉｔｓｄｏｗｎｓｔｒｅａｍＨｅｓｌ
ｍＲＮＡａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｒｅｓｕｌｔｓ
Ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅ
ｏｆ卟ｌ，Ｔｈｌ７
ａｎｄＴｒｅｇｃｅｌｌｓｉｎ
ＣＤ；Ｔ
ｃｅｌｌｓｏｆＣＯＰＤ
ｍｉｃｅ（１３．２０±０．９５，１０．２２±０．４５．
０．４１±０．０９）％ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｈｅａｌｔｈｙｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（８．０７４－０．４４．５．９８±０．２６，０．２６±０．０５）％（ａｌｌＰ＜０．０１）．ＴｈｅｐｒｏｐｏｒｔｉｏｎｏｆＴｈｌａｎｄＴｈｌ７ｃｅｌｌｓｉｎＣＯＰＤＧＳＩｇｒｏｕｐｍｉｃｅ（９．４８±０．６６，７．７０±０．３９）％ｗｅｒｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｒｅｄｕｃｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈＣＯＰＤｇｒｏｕｐ（ａｌｌＰ＜０．０１）．ＲａｔｉｏｏｆＴｈｌ／Ｔｈ２ｉｎＣＯＰＤｇｒｏｕｐ（１８．７０±４．１２）ｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔｈｅｈｅａｌｔｈｖｃｏｎｔｒｏｌｇｒｏｕｐ（１２．６３±１．９１）（Ｐ＜０．０１），ｔｈｅｐｅｒｃｅｎｔａｇｅｏｆＴｈｌ７ａｎｄＴｒｅｇｉｎＣＤ；Ｔｃｅｌｌｉｎｃｒｅａｓｅｄ７１％
ａｎｄ５８％ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＧＳＩｄｅｃｒｅａｓｅｄｔｈｅｒａｔｉｏｓｏｆＴｈｌ／Ｔｈ２ａｎｄＴｈｌ７／Ｔｒｅｇ（ａｌｌＰ＜０．０１）．ＮｏｔｅｈｌｒｅｃｅｐｔｏｒａｎｄｉｔｓｄｏｗｎｓｔｒｅａｍＨｅｓｌｍＲＮＡｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ（５．１５±０．７７，１．９２±０．３２）ａｎｄｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
（０．８５±０．０４，０．１６±０．０２）ｏｆ
ＣＯＰＤｍｉｃｅｗｅｒｅ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｉｎｃｒｅａｓｅｄｃｏｍｐａｒｅｄｗｉｔｈｔ１１ｅｈｅａｌｔｈｙｇｒｏｕｐ
ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ［（１．００±０．００，１．００±０．００）ａｎｄ（Ｏ．１７±０．０１，０．０９±０．０１）］（ａｌｌＰ＜０．０１）．ＧＳＩ
ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．ｉｓｓｎ．１００１－０９３９．２０１６．１１．０１２
作者单位：７３００００兰州大学第一医院老年呼吸科通信作者：刘晓菊，Ｅｍａｉｌ：ｌｉｕｘｉａｏｊｕ８３５＠１２６．ｃｏｍ
生堡箜蕉塑竖咝苤查垫！！生！！旦笠！！鲞筮！！塑堡ｈ也』！！ｂ！堡壁！！Ｅ堡旦堡：塑竺！些竺！Ｑ！！：！！！：！！：盟！：！！
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【Ｋｅｙｗｏｒｄｓ】Ｐｕｌｍｏｎａｒｙ
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Ｆｕｎｄｐｒｏｇｒａｍ：ＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＳｕｐｐｏａＰｒｏｇｒａｍｏｆＧａｎｓｕＰｒｏｖｉｎｃｅ（１４４ＦＫＣＡ０６２）；Ｓｃｉｅｎｃｅ
ａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙＰｒｏｇｒａｍｏｆＬａｎｚｈｏｕＣｉｔｙ（２０１４—１－３６）
慢性阻塞性肺疾病（慢阻肺）是以慢性气道炎症和持续气流受限为特征的常见气道疾病，其发病与肺部炎症反应、氧化应激、蛋白酶一抗蛋白酶失衡、自主神经功能失调等有关。近年来，研究发现慢阻肺的发生发展与免疫紊乱密切相关¨Ｊ。Ｎｏｔｃｈ信号是条高度保守的信号转导途径，在调控Ｔ淋巴细胞分化中发挥重要作用旧引。文献报道Ｎｏｔｃｈ信号通路参与哮喘等疾病的免疫失衡Ｈ引，但在慢阻肺中的作用鲜见报道。本研究以慢阻肺小鼠为研究对象，通过给予Ｎｏｔｃｈ信号通路特异性抑制剂１一分泌酶抑制剂（ＧＳＩ）阻断Ｎｏｔｃｈ信号通路，检测慢阻肺小鼠Ｔ细胞Ｎｏｔｃｈｌ受体及其下游分子Ｈｅｓｌ及Ｔ细胞亚群的比例，观察慢阻肺小鼠Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ的变化与Ｎｏｔｃｈ信号通路的关系，探讨慢阻肺免疫功能紊乱的发生机制，为防治慢阻肺奠定基础。
材料及方法
１．主要材料：兰州牌香烟（甘肃省烟草公司），藻红蛋白（ＰＥ）一花青燃料５（ＣＹ５）标记的抗小鼠ＣＤ４单克隆抗体、ＰＥ标记的抗小鼠白介素（ＩＬ）＿４单克隆抗体、ＰＥ标记的抗小鼠叉状头／翅膀状螺旋转录因子（Ｆｏｘｐ３）单克隆抗体、异硫氰酸荧光素（ＦＩＴＣ）标记的抗小鼠ＩＬ．１７Ａ单克隆抗体、ＦＩＴＣ标记的抗小鼠干扰素－＾ｙ（美国ＢｉｏＬｅｇｅｎｄ公司），逆转录试剂盒和实时荧光定量ＰＣＲ试剂盒（日本Ｔａｋａｒａ公司）。羊抗鼠Ｎｏｔｃｈｌ单克隆抗体（美国Ｓａｎｔａ
Ｃｒｕｚ
公司），兔抗鼠Ｈｅｓｌ单克隆抗体（英国Ａｂｃａｍ公司），ＧＳＩ（美国Ｓｉｇｍａ公司），ＬＳＲＦｏｒｔｅｓｓａＴＭ型流式细胞仪（美国ＢＤ公司），ＢＩＯ－ＲＡＤ
ＣｈｅｍｉＤｏｃⅢＸＲＳ
凝胶成像系统（美国Ｂｉｏ．Ｒａｄ公司），ＧＹＤ－００３型无创小鼠肺功能仪（法国Ｅｍｋａ公司）。
２．慢阻肺小鼠模型建立与实验分组：８周龄雄性ＢＡＬＢ／ｃ小鼠３０只，平均体重（２０±２）ｇ，购白兰州大学实验动物中心［批号ＳＣＸＫ（甘）２０１３－０００２＋］。
慢阻肺小鼠模型建立：采用单纯烟草烟雾暴露ｃｍ×３０ｃｍ×３５
ｃｍ有机玻璃箱
内，每１３暴露烟草烟雾４次（４支×４５ｍｉｎ），间
隔１ｈ，连续９０
ｄ∞。１。
分组：小鼠按随机数字表法分为３组：健康对照ｄ后，隔日腹腔注射ＧＳＩ（１ｍｇ／ｋｇ），共肺功能测定：造模结束后，采用小鼠无创肺功能ｍｉｎ，检测吸气峰流速（ＰＩＦ）、呼气峰流速（ＰＥＦ）和呼出５０％潮气量时的呼气流速（ＥＦＳ０）¨。。
肺组织病理标本采集、染色及测定：造模结束的计数，每只小鼠取３个肺组织病理切片，中倍镜下随机取５个视野（避开大血管和支气管），在每个视野正中心划十字交叉线，计数与交叉线相交的肺泡隔数（ＮＳ），同时测出十字线总长（Ｌ），按公式计算：ＭＬＩ＝Ｌ／ＮＳ，以表示肺泡平均内径归Ｊ。
３．脾脏淋巴细胞分离及Ｔ淋巴细胞提纯：无菌取小鼠脾脏，２００目滤网研磨过滤，调整细胞数１×１０８／ｍｌ，加于淋巴细胞分离液上，２５００转／ｍｉｎ，
ｍｉｎ，离心半径：１０ｃｍ，吸取中间层淋巴细胞，磷
酸盐缓冲液洗２次，ＲＰＭＩ．１６４０调整细胞数２×１０７／ｍｌ，尼龙毛柱过滤提纯Ｔ细胞¨１。，调整细胞数为２×１０６／ｍｌ，加入ＦＩＴＣ标记ＣＤ，抗体，流式细胞仪测定总Ｔ（ＣＤ；Ｔ）细胞。
４．ＣＤ４Ｔ淋巴细胞（ＣＤ；Ｔ）亚群检测：参照
Ｚｈａｎｇ等【ｌ纠方法，ＲＰＭＩ一１６４０调整脾淋巴细胞悬液细胞数２×１０６／ｍｌ，接种到２４孔板，加入佛波酯／离子霉素混合物和布雷菲德菌素／莫能菌素混合物，
５％ＣＯ，、３７
ｏＣ培养８ｈ，调整细胞数１×１０６／ｍｌ，加
入ＰＥ／ＣＹ５标记ＣＩＭ抗体，室温避光孵育２０ｍｉｎ；
法，将小鼠置于５０
组、慢阻肺组及慢阻肺ＧＳＩ组。慢阻肺ＧＳＩ组小鼠烟草烟雾暴露６１计１５次，其余两组注射等体积无菌双蒸水¨引。
检测系统检测小鼠肺功能，将小鼠置于体描箱内，在清醒和自由活动状态下适应５后，处死小鼠，取肺组织，４％多聚甲醛固定，石蜡包埋、切片，苏木素伊红（ＨＥ）染色，酒精脱水、烘干，中性树胶封片，进行肺组织切片肺泡平均间隔（ＭＬＩ）２０
虫垡缱拯塑哩噬盘查呈！！鱼生！！旦箜塑鲞箜！！翅ｇｂ也』旦！！望堕！！Ｐ堡旦堡：堕！！！堂竺！！！！：ｙ！！：！！：盟！：！１
４％多聚甲醛４℃固定１０ｍｉｎ后破膜，分别加入ＰＥ标记ＩＬ－４和ＦＩＴＣ标记干扰素－Ｙ、ＰＥ标记Ｆｏｘｐ３和ＦＩＴＣ标记ＩＬ．１７Ａ，室温避光孵育２０ｍｉｎ，流式细胞仪检测ＣＤ４Ｔ的Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ细胞比例。
５．实时荧光定量ＰＣＲ法检测Ｎｏｔｃｈｌ和Ｈｅｓｌ
０．０１，表１）。肺组织病理切片镜下可见慢阻肺组终末细支气管远端气腔膨胀，间隔变窄，弹力纤维变细或断裂，部分肺泡腔扩大、肺泡壁破裂，融合形成肺大疱，肺泡数目明显减少，肺泡间隔可见炎症细胞浸润，ＭＬＩ较健康对照组、慢阻肺ＧＳＩ组明显增加（均Ｐ＜０．０１），慢阻肺ＧＳＩ组小鼠炎症细胞浸润及肺气肿程度较慢阻肺组小鼠轻，健康对照组肺泡组织结构基本完整无异常。
２．Ｔ细胞鉴定：通过流式细胞仪检测总Ｔ细胞阳性率百分比为（８１．７６－４－１．５３）％。
３．ＣＤ４＋Ｔ淋巴细胞Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７、Ｔｒｅｇ及其比值：慢阻肺组较健康对照组Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７、Ｔｒｅｇ
ＣＤ４＋Ｔ
ｍＲＮＡ：提取总ＲＮＡ，逆转录试剂盒合成ｃＤＮＡ。引物：Ｎｏｔｃｈｌ上游：５
３７，下游：５
７．ＴＧＣＣＡＧＴＡＴＧＡＴＧＴＧＧＡＴＧＡＧ．
７一ＧＧＴＣＣＣＴＧＴＧＴＡＡＣＣＴＴＣＴＧＴ一３’，扩增
７一ＡＧＣＣＣＡＣＣＴＣＴＣＴＣＴ
长度１１１ｂｐ；Ｈｅｓｌ上游：５
ＴＣＴＧＡＣ．３
７，下游：５’一ＡＧＧＣＧＣＡＡＴＣＣＡＡＴＡＴＧＡＡＣ一
３’，扩增长度１８７ｂｐ；１３一ａｃｔｉｎ上游：５’一ＣＣＴＣＴＡＴＧＣ
ＣＡＡＣＡＣＡＧＴＧＣ．３’，
下游：
５’一ＡＴＡＣＴＣＣＴＧＣＴＦ
及Ｔｈｌ／Ｔｈ２比值均明显高于健康对照组，Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ无明显差异；慢阻肺组Ｔｈｌ７／ＣＤ；Ｔ、Ｔｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔ较健康对照组分别升高７１％、５８％；ＧＳＩ能明显降低慢阻肺组Ｔｈｌ／ＣＤ４＋Ｔ、Ｔｈｌ７／ＣＤ４＋Ｔ及Ｔｈｌ／Ｔｈ２和Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ的比值，均Ｐ＜０．０１，ＧＳＩ降低慢阻肺组
Ｔｈｌ７／ＣＤ；Ｔ
ＧＣＴＧＡＴＣＣ．３’，扩增长度２１１ｂｐ；反应体系２０汕ｌ，扩
增条件：９５℃预变性３０
０．５
Ｓ，９５
ｏＣ变性５
ｓ，６０
ｏＣ退火
延伸３４Ｓ，共４０个循环，溶解６５～９５℃，每５Ｓ上升
ｏＣ；基因表达采用２“们‘法。
６．Ｗｅｓｔｅｒｎ
ｂｌｏｔ法检测Ｎｏｔｃｈｌ和Ｈｅｓｌ蛋白：提２５％，升高Ｔｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔ１０％（表２）。
取总蛋白测定蛋白含量，取５０¨ｇ蛋白样品，１０％十二烷基硫酸钠．聚丙烯酰胺凝胶电泳，转至聚偏氟乙烯膜，５％脱脂奶粉室温封闭２ｈ，羊抗鼠Ｎｏｔｃｈｌ多克隆抗体（１：２００）、兔抗鼠Ｈｅｓｌ多克隆抗体
（１：７５００）及内参照物兔抗鼠甘油醛一３．磷酸脱氢酶（ＧＡＰＤＨ）（１：２００）４ｏＣ过夜，兔抗羊ＩｇＧ（１：２０００）、
４．Ｔ淋巴细胞Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达：慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白较健康对照组明显增加（均Ｐ＜０．０１），ＧＳＩ明显抑制慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达，均Ｐ＜Ｏ．０１（表３）。
５．相关性分析：慢阻肺组Ｎｏｔｃｈｌ和ＨｅｓｌｍＲＮＡ、蛋白的表达与Ｔｈｌ／ＣＤ４＋Ｔ、Ｔｈｌ７／ＣＤ４＋Ｔ细胞比例呈正相关，与Ｔｈ２／ＣＤ，＋Ｔ、Ｔｒｅｇ／ＣＤ４＋Ｔ细胞比例呈负相关（表４）。
讨
论
羊抗兔ＩｇＧ（１：２０００）室温２ｈ，显影，检测蛋白条带。蛋白相对表达为目的基因灰度值／内参基因灰度值。
７．统计学处理：采用ＳＰＳＳ２１．０软件进行统计学分析，计量资料数据以元±ｓ表示，组间比较采用单因素方差分析和ＬＳＤ—ｔ检验，Ｐｅａｒｓｏｎ法进行相关性分析，以Ｐ＜０．０５为差异有统计学意义。
结
果
慢阻肺的发生发展与免疫紊乱密切相关，研究发现慢阻肺患者存在Ｔｈｌ／Ｔｈ２失衡，且以Ｔｈｌ型细胞增多为主¨Ｊ。慢阻肺小鼠肺内Ｔｈｌ细胞的增多产生干扰素一＾ｙ，促进炎性细胞肺内积聚，破坏肺脏结构的完整性¨３Ｉ。新近研究发现Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ细胞也参与慢阻肺的发病，Ｔｈｌ７细胞主要分泌ＩＬ一１７Ａ、
１．慢阻肺模型：慢阻肺组肺功能ＰＩＦ、ＰＥＦ和ＥＦ５０明显低于健康对照组和慢阻肺ＧＳＩ组（均Ｐ＜
表１健康对照组、慢阻肺组小鼠肺功能的比较（面±ｓ）
注：ＰＩＦ：吸气峰流速；ＰＥＦ：呼气峰流速；ＥＦ５０：呼出５０％潮气量时的呼气流速；ＭＬＩ：平均肺泡间隔；８Ｐ＜０．０１为与健康对照组比较；“Ｐ＜０．０１为与慢阻肺组比较
主堡结蕉塑哩哩苤查呈！！！生！！旦筮！！鲞筮！！翅曼！也』旦！！翌曼塑巳堡旦亟堕！！！里！竺！Ｑ！！：ｙ！！：塑：盟！：！！表２各组小鼠脾源性Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｒｅｇ和Ｔｈｌ７细胞比例的比较（面±ｓ）
注：与健康对照组比较，８ｔ值为３．０３～２５．７９，均Ｐ＜０．Ｏｌ；与慢阻肺组比较，“ｔ值为３．３１～１３．２９，均Ｐ＜Ｏ．０１
表３各组Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达结果比较（面±Ｓ，Ａ）
注：ｍＲＮＡ：２—６△Ｑ值；蛋白：目的基因灰度值／内参基因灰度值；与健康对照组相比，８ｔ值为１０．３４～４９．１９，均Ｐ＜０．０１；与慢阻肺组相比，“ｔ值为５．７２～１８．７５，均Ｐ＜０．０１
表４慢阻肺组各数据相关性分析
Ｔｒｅｇ细胞高，表明慢阻肺小鼠除存在Ｔｈｌ／Ｔｈ２失衡外，仍以Ｔｈｌ７细胞增加为主，而具有免疫抑制的Ｔｒｅｇ细胞增加不足，致免疫失控，肺组织炎性损伤持续。
Ｎｏｔｃｈ信号通路通过细胞间的相互作用，参与Ｔ细胞的活化、增殖和分化，进而在多种疾病的免疫失
注：ｍＲＮＡ：２一她ａ值；蛋白：目的基因灰度值／内参基因灰度值；８Ｐ＜０．Ｏｌ，６Ｐ＜０．０５
衡中起重要作用。各种成熟的免疫细胞和抗原提呈细胞等表面都有Ｎｏｔｃｈ受体和配体的表达，Ｎｏｔｃｈ是一种单次跨膜受体蛋白，哺乳动物体内有４种同源的Ｎｏｔｃｈ受体，即Ｎｏｔｃｈｌ／２／３／４，同时还有５种同源配体即Ｊａｇｇｅｄｌ／２、Ｄｅｌｔａｌ／３／４，通过细胞间的相互接触及１一分泌酶酶解后，活化下游靶基因Ｈｅｓ和Ｈｅｙ家族，共同参与Ｔ细胞的活化、增殖和分化，尤其在Ｔｈｌ、Ｔｈ２、Ｔｈｌ７及Ｔｒｅｇ等细胞分化中作用显
ＩＬ－６等加重慢阻肺气道炎症，分化成熟的Ｔｈｌ７细胞促使小鼠气道高表达ＣＣＲ６趋化因子受体，趋化中性粒细胞进人肺组织释放中性粒细胞弹力蛋白酶破坏肺组织，加剧气道炎症及肺气肿ｏ１４］。Ｔｒｅｇ细胞是调节性Ｔ细胞，是ＣＤ４Ｔ细胞中有免疫抑制和免疫调节效应的亚群，它可以通过细胞间的直接接触或分泌ＩＬ－１０和转换生长因子（ＴＧＦ）一Ｂ减轻过度的免疫应答，在慢性炎症和自身免疫疾病中起重要作用。
Ｅｐｐｅｒｔ等。１３。发现慢性香烟暴露增加小鼠肺脏Ｔｈｌ
著‘３川８。。Ｙｕ等‘１９１发现Ｎｏｔｃｈ信号通路抑制剂ＧＳＩ
可使Ｎｏｔｃｈ信号通路失活，使特发性血小板减少性紫癜患者Ｔｈｌ７细胞及Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ比值显著下降致免疫失衡。Ｚｈａｎｇ等㈣ｏ发现ＧＳＩ可减轻卵清蛋白诱导的哮喘的进展，抑制脾脏Ｔｈｌ７反应、降低血清ＩＬ一１７，抑制气道炎症和减轻临床症状，说明ＧＳＩ抑制Ｎｏｔｃｈ信号通路调节Ｔｈｌ７。ＧＳＩ可使过敏性哮喘小鼠肺泡灌洗液Ｔｈ２向Ｔｈｌ的漂移，这种表型的改变与炎性细胞Ｎｏｔｃｈ信号相关分子，如ＧＡＴＡ－３、Ｈｅｓｌ和Ｎｏｔｃｈ胞内段的变化一致，表明Ｎｏｔｃｈ信号通路参与过敏性哮喘的免疫失衡¨０｜。“等心川发现，慢性香烟烟雾暴露小鼠其气管旁淋巴结所有Ｎｏｔｃｈ受体和配体的表达均增高，尤以Ｎｏｔｃｈ３和Ｄｅｈａｌ的增高
和Ｔｈｌ７细胞，而Ｔｈ２细胞无明显变化。慢阻肺患者痰中Ｔｒｅｇ和Ｔｈｌ７细胞均增加【ｌ５｜，稳定期和急性加重慢阻肺患者外周血中Ｔｒｅｇ细胞的比例明显升高，而Ｔｒｅｇ／ＩＬ一１７比值无明显变化¨６Ｉ。本研究结果显示慢阻肺小鼠Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ细胞分别较健康对照组升高６４％、７１％、５８％，Ｔｈ２细胞无明显改变，Ｔｈｌ／Ｔｈ２的比值明显增加，而Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ的比值变化不大，考虑慢阻肺小鼠Ｔｈｌ７和Ｔｒｅｇ细胞比例较健康对照小鼠均增加，但Ｔｈｌ７细胞增加的幅度较
虫堡笪篮塑唑咝苤查兰！！鱼生！！旦箜！！鲞箜！！翅￡！也』！！！！丝垦！１２生堕！：盟！！！塑堡！垫！鱼：！尘：翌：塑！：！！
・８８５・
明显，这和小鼠肺气肿样形态学变化和Ｔｈｌ占优势的炎症一致。本研究结果表明，ＧＳＩ明显抑制慢阻肺组小鼠Ｔｈｌ和Ｔｈｌ７细胞，降低Ｔｈｌ／Ｔｈ２和Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ的比值，说明ＧＳＩ阻断Ｎｏｔｃｈ信号通路减少促炎的Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７细胞，改善Ｔｈｌ／Ｔｈ２、Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ比例，表明Ｎｏｔｃｈ信号通路可能部分参与调控慢阻肺小鼠Ｔｈｌ／Ｔｈ２、Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ免疫失衡。研究还发现慢阻肺小鼠脾源性Ｔ细胞Ｎｏｔｃｈｌ及其下游ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达明显升高，且Ｎｏｔｃｈｌ及ＨｅｓｌｍＲＮＡ和蛋白的表达与Ｔｈｌ／ＣＤ；和Ｔｈｌ７／ＣＤ４＋细胞呈正相关，与Ｔｈ２／ＣＤ；和Ｔｒｅｇ／．ＣＤ４＋细胞比例呈负相关，ＧＳＩ能部分抑制Ｎｏｔｃｈｌ、Ｈｅｓｌ的表达和Ｔｈｌ及Ｔｈｌ７细胞，表明Ｎｏｔｃｈｌ、Ｈｅｓｌ的高表达与Ｔｈｌ和Ｔｈ７细胞增加有关，与Ｔｈ２和Ｔｒｅｇ细胞降低有关，Ｔｈｌ７信号通路可能通过调节Ｔｈｌ／Ｔｈ２、Ｔｈｌ７／Ｔｒｅｇ失衡参与慢阻肺的免疫紊乱。
总之，慢阻肺小鼠存在Ｔ细胞亚群失衡，以Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７等促炎细胞增多为主；Ｎｏｔｃｈｌ及其下游
Ｈｅｓｌ
ｍＲＮＡ及蛋白水平升高，且与Ｔ淋巴细胞亚群
失衡相关；ＧＳＩ能部分抑制Ｎｏｔｃｈｌ、Ｈｅｓｌ的表达及Ｔｈｌ、Ｔｈｌ７细胞；Ｎｏｔｃｈ信号通路参与慢阻肺的免疫紊乱。
参考文献
ｌ】ＢｒｕｓｓｅｌｌｅＧＧ，Ｊｏｏｓ
ＧＦ，Ｂｒａｃｋｅ
ＫＲ．Ｎｅｗ
ｉｎｓｉｇｈｔｓ
ｉｎｔｏ
ｔｈｅ
ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙｏｆｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙ
ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．Ｌａｎｃｅｔ，
２０ｌｌ，３７８（９７９５）：１０１５－１０２６．ＤＯＩ：１０．１０１６／Ｓ０１４０－６７３６（１１）
６０９８８４．２
ＤｅＯｂａｌｄｉａ
ＭＥ，ＢｈａｎｄｏｏｌａＡ．Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎａｌｒｅｇｕｌａｔｉｏｎｏｆｉｎｎａｔｅ
ａｎｄａｄａｐｔｉｖｅｌｙｍｐｈｏｃｙｔｅｌｉｎｅａｇｅｓ［Ｊ］．Ａｎｎｕ
ＲｅｖＩｍｍｎｎｏｌ，２０１５，
３３：６０７拼２．ＤＯＩ：１０．１１４６／ａｎｎｕｒｅｖ—ｉｍｍｕｎｏｌ－０３２４１４—１１２０３２．
３］Ｒａｄｔｋｅ
Ｆ，ＭａｃＤｏｎａｉｄ
ＨＲ，Ｔａｃｃｈｉｎｉ—Ｃｏｔｔｉｅｒ
Ｆ．Ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆ
ｉｎｎａｔｅａｎｄａｄａｐｔｉｖｅ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ
ｂｙ
Ｎｏｔｃｈ［Ｊ］．ＮａｔＲｅｖＩｍｍｕｎｏｌ，
２０１３，１３（６）：４２７－４３７．ＤＯＩ：ｌＯ．１０３８／ｎ＾３４４５．
［４］ＫａｎｇＪＨ，Ｋｉｍ
ＢＳ，ＵｈｍＴＧ，ｅｔ
ａ１．Ｇａｍｍａ—ｓｅｃｒｅｔａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒ
ｒｅｄｕｃｅｓａｌｌｅｒｇｉｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ
ｂｙ
ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇＴｈｌａｎｄ
Ｔｈ２
ｒｅｓｐｏｎｓｅｓ［Ｊ］．ＡｍＪＲｅｓｐｉｒＣｒｉｔＣａｒｅ
Ｍｅｄ，２００９，１７９（１０）：
８７５－８８２．ＤＯＩ：１０．１１６４／ｒｃｅｍ．２００８０６－８９３０Ｃ．
［５］Ｇｕｗ，ｘｕＷ，Ｄｉｎｇ
Ｔ，ｅｔａ１．ＦｒｉｎｇｅｃｏｎｔｒｏｌｓｎａｉｖｅｃＤ４（＋）Ｔ
ｃｅｌｌｓ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｔｈｒｏｕｇｈ
ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ
ｎｏｔｃｈ
ｓｉｇｎａｌｉｎｇ
ｉｎ
ａｓｔｈｍａｔｉｃ
ｒａｔ
ｍｏｄｅｌｓ［Ｊ］．ＰＬｏｓＯｎｅ，２０１２，７（１０）：ｅ４７２８８．ＤＯＩ：
ｌＯ．１３７ｌ／ｉｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．００４７２８８．
６
Ｌｉ
Ｌ，Ｂａｏ
Ｈ，Ｗｕ
Ｊ，ｅｔ
ａ１．Ｂａｉｃａｌｉｎ
ｉｓ
ａｎｔｉ－ｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ｉｎ
ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅ—ｉｎｄｕｃｅｄｉｎｆｌａｍｍａｔｏｒｙ
ｍｏｄｅｌｓｉｎｖｉｖｏａｎｄｉｎｖｉｔｒｏ：
Ａｐｏｓｓｉｂｌｅ
ｒｏｌｅ
ｆｏｒＨＤＡＣ２
ａｃｔｉｖｉｔｙ
ＪＩ．ＩｎｔＩｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ，
２０１２，１３（１）：１５－２２．ＤＯｌ：１０．１０１６／ｊ．ｉｎｔｉｍｐ．２０１２．０３．００１．
［７］邱敬满，刘晓菊，褚旭，等．黄芪多糖对ＰＭ２．５致慢性阻塞
性肺疾病肺泡巨噬细胞吞噬功能下降的保护机制［Ｊ］．中华结核和呼吸杂志，２０１６，３９（２）：１４４—１４７．ＤＯＩ：１０．３７６０／ｃｍａ．ｊ．
ｉｓｓｎ．１００１．０９３９．２０１６．０２．０１８．
［８］
ＧｌａａｂＴ，ＴａｕｂｅＣ．ＢｒａｕｎＡ，ｅｔａ１．Ｉｎｖａｓｉｖｅａｎｄｎｏｎｉｎｖａｓｉｖｅ
ｍｅｔｈｏｄｓｆｏｒｓｔｕｄｙｉｎｇｐｕｌｍｏｎａｒｙｆｕｎｃｔｉｏｎ
ｉｎ
ｍｉｃｅ［Ｊ］．Ｒｅｓｐｉｒ
Ｒｅｓ，
２００７，８：６３．ＤＯＩ：１０．１１８６／１４６５－９９２１－８－６３．
［９］
ＴａｎａｋａＫ，ＫｕｒｏｔｓｕＳ，ＡｓａｎｏＴ，ｅｔａ１．Ｓｕｐｅｒｉｏｒｉｔｙｏｆｐｕｌｍｏｎａｒｙ
ａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎ
ｏｆ
ｍｅｐｅｎｚｏｌａｔｅ
ｂｒｏｍｉｄｅ
ｏｖｅｒ
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ｒｏｕｔｅｓ
ａｓ
ｔｒｅａｔｍｅｎｔｆｏｒｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ｓｃｉ
Ｒｅｐ，
２０１４，４：４５１０．ＤＯＩ：１０．１０３８／ｓｒｅｐ０４５１０．
［１０］
Ｍｉｙａｍｏｔｏ
Ｓ，Ｎａｋａｎｉｓｈｉ
Ｍ，Ｒｏｓｅｎｂｅｒｇ
ＤＷ．Ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃｏｌｏｎ
ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓｂｙ
ｔａｒｇｅｔｉｎｇＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇ［Ｊ］．Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ，
２０１３，３４（１０）：２４１５－２４２３．ＤＯＩ：１０．１０９３／ｃａｒｃｉｎ／ｂｇｔｌ９１．ＷｏｈｌｅｒＪＥ．Ｂａｒｎｕｍ
ＳＲ．
Ｎｙｌｏｎ
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ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ
ａｌｔｅｒｓ
ｔｈｅ
ａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＴ
ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＭｏｌＩｒｏｍｕｎｏｌ，２００９，４６（５）：１００７－１０１０．
ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｍｏｌｉｍｍ．２００８．０９．０１７．
［１２］
Ｚｈａｎｇ
ＭＱ，ＷａｎＹ，ＪｉｎＹ，ｅｔａ１．Ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｉｎｇｐｒｏｍｏｔｅｓ
ｉｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎｉｎｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈＣＯＰＤｂｙａｆｆｅｃｔｉｎｇｔｈｅｐｏｌａｒｉｚａｔｉｏｎ
ａｎｄｓｕｒｖｉｖａｌ
ｏｆ
Ｔｈ／Ｔｒｅｇｓｔｈｍｕｇｈｕｐ—ｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ
ｏｆｍｕｓｅａｒｉｎｉｅ
ｒｅｃｅｐｔｏｒ３
ａｎｄ
５
ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ［Ｊ］．ＰＬｏＳＯｎｅ，２０１４，９（１１）：
ｅ１１２３５０．ＤＯＩ：１０．１３７１／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１２３５０．
［１３］
Ｅｐｐｅｒｔ
ＢＬ，Ｗｏｒｔｈａｍ
ＢＷ，Ｆｌｕｒｙ
ＪＬ，ｅｔ
ａ１．Ｆｕｎｅｔｉｏｎａｌ
ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＴｃｅｌｌｐｏｐｕｌａｔｉｏｎｓｉｎ
ａ
ｍｏｕｓｅｍｏｄｅｌｏｆｃｈｒｏｎｉｃ
ｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙ
ｄｉｓｅａｓｅ［Ｊ］．ＪＩｍｍｕｎｏｌ，２０１３，１９０（３）：
１３３１—１３４０．ＤＯＩ：１０．４０４９／ｊｉｍｍｕｎ０１．１２０２４４２．
［１４］
ＭｉｏｓｓｅｃＰ，ＫｏｒｎＴ，ＫｕｃｈｒｏｏＶＫ．Ｉｎｔｅｒｌｅｕｋｉｎ一１７
ａｎｄｔｙｐｅ
１７
ｈｅｌｐｅｒＴ
ｃｅｌｌｓ［Ｊ］．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ，２００９，３６１（９）：８８８－８９８．ＤＯＩ：
１０．１０５６／ＮＥＪＭｒ扣７０７４４９．
［１５］
ＬｉＨ，Ｌｉｕ
Ｑ，Ｊｉａｎｇ
Ｙ，ｅｔ
ａ１．Ｄｉｓｒｕｐｔｉｏｎｏｆｔｈｌ７／ｔｒｅｇｂａｌａｎｃｅｉｎ
ｔｈｅｓｐｕｔｕｍｏｆｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｃｈｒｏｎｉｃｏｂｓｔｒｕｃｔｉｖｅｐｕｌｍｏｎａｒｙｄｉｓｅａｓｅ
［Ｊ］．ＡｍＪ
Ｍｅｄ
Ｓｃｉ，２０１５，３４９（５）：３９２－３９７．ＤＯＩ：１０．１０９７／
ＭＡＪ．０｜Ｄ０００００００１００００４｛７．
［１６］
ＪｉｎＹ。ＷａｎＹ，ＣｈｅｎＧ，ｅｔａ１．Ｔｒｅｓ／ＩＬ一１７
ｒａｔｉｏ
ａｎｄＴｒｅｇ
ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎｉｎ
ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ
ＣＯＰＤ［Ｊ】．ＰＬｏＳ
Ｏｎｅ，２０１４，９
（１０）：ｅ１１１０４４．ＤＯＩ：１０．１３７ｌ／ｊｏｕｒｎａｌ．ｐｏｎｅ．０１１１０４４．
［１７］
ＡｍｓｅｎＤ，ＨｅｌｂｉｇＣ，ＢａｃｋｅｒＲＡ．ＮｏｔｃｈｉｎＴＣｅｌｌＤｉｆｉｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ：ＡｌｌＴｈｉｎｇｓ
Ｃｏｎｓｉｄｅｒｅｄ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓＩｍｍｕｎｏｌ，２０１５，３６（１２）：８０２・
８１４．ＤＯＩ：１０．１０１６／ｊ．ｉｔ．２０１５．１０．００７．［１８］
ＩｔｏＴ，ＣｏｎｎｅｔｔＪｉ．ＫｕｎｋｅｌＳＬ，ｅｔａ１．Ｎｏｔｃｈｓｙｓｔｅｍｉｎｔｈｅｌｉｎｋａｇｅ
ｏｆｉｎｎａｔｅ
ａｎｄａｄａｐｔｉｖｅ
ｉｍｍｕｎｉｔｙ［Ｊ］．ＪＬｅｕｋｏｅＢｉｏｌ，２０１２，９２
（１）：５９－６５．ＤＯＩ：１０．１１８９／ｊｌｂ．１０１１５２９．
［１９］
Ｙｕ
Ｓ，ＬｉｕＣ，ＬｉＬ，ｅｔａ１．ＩｎａｃｔｉｖａｔｉｏｎｏｆＮｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇｒｅｖｅｒｓｅｓ
ｔｈｅＴｈｌ７／Ｔｒｅｇ
ｉｍｂａｌａｎｃｅ
ｉｎ
ｃｅｌｌｓｆｒｏｍ
ｐａｔｉｅｎｔｓ
ｗｉｔｈ
ｉｍｍｕｎｅ
ｔｈｒｏｍｂｏｅｙｔｏｐｅｎｉａ［Ｊ］．ＬａｂＩｎｖｅｓｔ，２０１５，９５（２）：１５７—１６７．ＤＯＩ：
１０．１０３８／ｌａｂｉｎｖｅｓｔ．２０１４．１４２．
Ｚｈａｎｇ
Ｗ，Ｚｈａｎｇ
Ｘ，ＳｈｅｎｇＡ，ｅｔａ１．１／－ＳｅｅｒｅｔａｓｅＩｎｈｉｂｉｔｏｒ
ＡｌｌｅｖｉａｔｅｓＡｃｕｔｅＡｉｒｗａｙＩｎｆｌａｍｍａｔｉｏｎ
ｏｆＡｌｌｅｒｇｉｃ
ＡｓｔｈｍａｉｎＭｉｃｅ
ｂｙ
Ｄｏｗｎｒｅｇｎｌａｔｉｎｇ
Ｔｈｌ７Ｃｅｌｌ
Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
Ｊ１．Ｍｅｄｉａｔｏｒｓ
Ｉｎｆｌａｍｍ．２０１５．２０１５：２５８１６８．ＤＯＩ：１０．１
１５５／２０１５／２５８１６８．
ＬｉＳ，Ｈｕ
Ｘ，ＷａｎｇＺ，ｅｔａ１．Ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｐｒｏｆｉｌｅｓｏｆｎｏｔｃｈｓｉｇｎａｌｉｎｇ
ｉｎ
ｃｉｇａｒｅｔｔｅｓｍｏｋｅ－ｉｎｄｕｃｅｄｐｕｌｍｏｎａｒｙｅｍｐｈｙｓｅｍａａｎｄｂｌｅｏｍｙｃｉｎ－－
ｉｎｄｕｃｅｄｐｕｌｍｏｎａｒｙｆｉｂｒｏｓｉｓ［Ｊ］．ＩｎｆｌａｍｍＲｅｓ，２０１５，６４（５）：３６３－
３７１．ＤＯＩ：１０．１００７／ｓ０００１１．０１５旬８１６一Ｙ．
（收稿日期：２０１６－０３－０４）
（本文编辑：蔡蜀菁）
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