LuxR 蛋白家族的蛋白结构分析与改造设计
622
（山东大学生命科学学院，济南，250100）
摘要：LuxR 家族调控蛋白是一类在革兰氏阴性细菌群体感应中起重要作用的调控蛋白，它们参与由酰基高丝氨酸内酯（AHL ）介导的多种生物学过程，调控细菌生物发光、质粒转移、生物膜形成以及多种胞外酶、毒力因子和次生代谢产物的合成。在代谢工程和合成生物学中，对LuxR 蛋白进行改造来改变LuxR 与AHL 的结合活性，从而调控代谢流，具有重大意义。本文以TraR 为例，对其结构和功能域进行了分析，回顾了此领域定向进化的工作，并提出了理性设计的蛋白质改造策略，期望构建具有不同结合活性的LuxR 蛋白。 关键词：群体感应LuxR 蛋白质工程
一、 群体感应
细胞与细胞之间信息交流一般被认为只在多细胞生物中发生，而细菌往往被纯粹地看作单细胞生物。在20世纪60年代一种海洋费氏弧菌（Vibrio fischeri）的发光现象引起了科学家的兴趣，Nealson 等在1970年首次报道了该菌菌体密度与生物发光呈正相关，该发光现象受细菌本身的群体感应调节系统（Quorum-Sensing System，QS ）所控制。
细菌根据特定信号分子的浓度可以监测周围环境中自身或其它细菌的数量变化，当信号达到一定的浓度阈值时，能启动菌体中相关基因的表达来适应环境中的变化，这一调控系统被称为细菌的群体感应调节系统。该系统首先由酶催化合成信号分子（自体诱导分子，autoinducer ，AI ，也称信息素pheromon) ，信号分子经扩散或转运系统到达胞外，当累计到一定浓度后，能被位于膜上的感应系统识别，进而引起受体蛋白的构象或基团变化，最终激活靶基因的表达，该表达产物能使细菌适应外界环境各种变化。
不同菌体QS 系统利用不同的信号分子来调控基因的表达。革兰氏阴性（G-）细菌一般利用酰基高丝氨酸环内酯类物质（AHL ）、革兰氏阳性（G+）细菌利用寡肽类（AIP ）信号感知自身种群数量；另外还有一类信号分子是呋喃酰硼酸二酯（AI-2），在G+ 与G- 细菌中均存在，它可感知其它种间细菌数量来调控自身行为。
我们以费氏弧菌为例介绍在G-菌QS 系统中LuxR 蛋白的功能（如图1）。首先，LuxI 基因编码的蛋白酶会催化AHL 小分子的形成，随着细胞密度的增大，AHL 的密度增大，AHL 可以和LuxR 蛋白结合使LuxR 蛋白具有与DNA 结合的能力，LuxR 复合物能激活PluxR 启动子
增强下游包括LuxR 及荧光相关蛋白的表达，从而使成群的费氏弧菌发出荧光。
在合成生物学中，我们把LuxR 基因、PluxR 启动子、AHL 等基因重新组装，来同步不同细胞的生理状态，而LuxR 与AHL 结合活性会深刻影着AHL 的阈值。如果能够设计出更灵敏或者更迟钝的LuxR 蛋白的基因，就可以根据需要利用群感系统在合适的生理状态同步表达基因。
图1费氏弧菌群体感应相关基因
二、 LuxR 蛋白的结构分析
从NCBI 中可以得到费氏弧菌LuxR 的蛋白质序列如下：
>gi|37223202|gb|AAQ90196.1| LuxR [Vibrio fischeri ES114]
MNIKNINANEKIIDKIKTCNNNKDINQCLSEIAKIIHCEYYLFAIIYPHSIIKPDVSIIDNYPEKWRKYY DDAGLLEYDPVVDYSKSHHSPINWNVFEKKTIKKESPNVIKEAQESGLITGFSFPIHTASNGFGMLSFAH SDKDIYTDSLFLHASTNVPLMLPSLVDNYQKINTTRKKSDSILTKREKECLAWASEGKSTWDISKILGCS ERTVTFHLTNTQMKLNTTNR
另外，农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 中TraR 是LuxR 家族的另一著名蛋白，NCBI 中找到它的序列为
>gi|190014846|ref|YP_001967610.1| TraR [Agrobacterium tumefaciens]
MQHWLDKLTDLAAIEGDECILKTGLADIAEHYGFTGYAYLHIQHRHITAVTNYHREWQSTYFDKKLVALD PVVKRARSRKHIFTWSGEQERPSLSRDERSFYARAADFGIRSGITIPIRTANGSMSMFTLASDKPVIDLD REIDAVAAASTIGQIHARISYLRTTPTAEDAAWLDPKEASYLRWIAVGMTMEEIADVEGVKYNSVRVKLR EAMKRFDVHSKAHMIALAIRRKLI
二者在序列上相似度小于20%，用muscle3.8.31_i86win32进行简单粗糙比对，结果如图2，可以看出一级序列差别很大。但是，二者的蛋白立体结构是非常相似的。
图2 muscle 多序列比对结果
在1990年的时候，科学界就通过突变方式确定了LuxR 蛋白C 端与DNA 结合的区域以及N 端与AHL 结合的区域。在2002年，TraR 的晶体结构被解析出来，在pdb 库中是1H0M 和1L3L ，图2是1L3L 的结构图。
图3 1L3L在spbviwer 中显示的条带结构图
在此之前，人们已经通过突变体和blast 同源蛋白家族等手段分析出了LuxR 相关的保守活性位点及功能区域（如图4）。
图4TraR 中的二级结构、功能域及保守位点分析
结构与功能关系上，LuxR 蛋白N 端为信号分子AHL 的结合区域，占整个蛋白的三分之二；C 端含有保守的螺旋-转角-螺旋(helix-turnhelix,HTH)结构，能够与目的基因特异结合。
对根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 中TraR 的结构分析表明，它具有AHL 结合区域(图5) 。此区域由相连的五个反向平行的b 片层折叠与三个a 螺旋组成。AHL 通过四个氢键与TraR 蛋白结合，这四个氢键分别在AHL 的3-酮基基团和水分子(图5①) 、Tyr53 和1- 酮基基团(图5 ②) 、AHL 的酮基环和残基Trp57(图5 ③) 和残基Asp70 和亚氨基团之间(图5 ④) 。其中Thr129 和Ala38 用来稳定第一个氢键(图5 ①) 。在与AHL 形成氢键的氨基酸残基中，Trp57 和Asp70 在LuxR 型蛋白家族中严格保守。AHL 的酰胺侧链与b 片层折叠平行，通过疏水作用与Leu40、Thr51、Tyr53、Tyr61、Phe62、Val72、Trp85 和Ile110 作用进一步稳定。在这些与酰胺侧链相互作用的氨基酸残基中，由于酰胺侧链长度的可变性和LuxR 家族蛋白的多样性，只有Tyr61 和Trp85 严格保守。在TraR 中，Phe62 主要负责酰胺侧链末端与配体结合后的封闭作用，所以AHL 能够不可逆地与TraR 结合。而在其他的LuxR 型蛋白中Phe62 不保守，且在相应的位置比Phe 所占空间小，导致AHL 结合位点打开，所以AHL 与其他LuxR 蛋白的结合是可逆的。
前面QS 系统的介绍中，我们知道，LuxR 家族蛋白大部分为激活子，LuxR 蛋白与DNA 作用会诱导RNA 聚合酶与目的基因启动子结合，进而启动转录。我们很容易理解，在这一过程中，AHL 与LuxR 蛋白的结合是LuxR 与目的基因结合的先决条件，如果没有AHL ，N 端会遮盖C 端的DNA 结合域，干扰DNA 与LuxR 结合；如果AHL 存在，就会促使LuxR 的DNA 结合域暴露，但是AHL 与LuxR 蛋白的结合是如何导致C 端构象变化的还有待进一步研究。
图5TraR 与AHLs 的结合区域
AHL 与TraR 结合形成氢键的简图。虚线框中的分子式为AHLs
的基本结构，①②③④为AHLs 与TraR 蛋白结合的四个氢键。
三、 LuxR 蛋白的定向进化
为了能够使LuxR 可以敏锐地探测到更低浓度的AHL 变化，我们可以通过定向进化的方法得到想要得到的LuxR 蛋白。基本思路如图6。通过这个策略，我们能够将LuxR 的敏感度由最初的1000nm 提升到10nm 。我们可以构建一个正反馈（PFL1）以及增加拷贝数加强LuxR 的表达量（PPL2）来提高敏感度，在此基础上，我们可以利用易错PCR 突变luxR 来获得突变体库，依据UV 激发下表达荧光的时间先后来定义或筛选LuxR 蛋白。现在如果重复论文中的实验，易错PCR 可以很容易购买到相关的kit ，并不需要自己调配体系；以质粒上LuxR 基因两端设计两对引物，采用Gibson 组装的方法可以取代传统的酶切连接，提高效率。当然，缺乏高通量的筛选策略，这依旧不是一件简单的事情。
图6正反馈和定向进化的策略
在得到一系列期望的敏感突变后，我们可以用shuffling 的方法将突变位点进行整合，以得到更加灵敏的突变体。
图7易错PCR 及DNA 重排
四、 LuxR 蛋白的理性设计
虽然没有搜到费氏弧菌中LuxR 蛋白的结构资料，但是我们对其同源蛋白Trar 的背景十
分了解。可以以此为依据理性设计LuxR ，改变它的结合活性。我们对TraR 结合DNA 及AHL 的机制了解地比较清楚，但TraR 结合AHL 后构型改变的变化机制并不清楚，我们可以去改造LuxR 与AHL 结合的部位。
除了已有的结构知识，一些单核苷酸或多核苷酸突变的分析数据（表1、表2）也可以为我们的理性设计提供参考。
表格1单核苷酸位点突变对LuxR 结合活性的影响
表格2多核苷酸位点突变对LuxR 结合活性的影响
但实际上，我们即使拥有了如此丰富的背景资料，理性设计LuxR 蛋白还是非常困难的，即使设计出对定点突变的方案，也是需要筛选的。一个可选的方案是，用计算机模拟突变，然后分子动力学模拟构型变化，比较前后的结构变化，但这也需要时间和硬件成本，况且并不可靠。目前来看，定向进化还是主要的选择。
参考文献：
[1] Slock J, VanRiet D, Kolibachuk D, et al. Critical regions of the Vibrio fischeriluxR protein defined by mutational analysis[J]. Journal of bacteriology, 1990, 172(7): 3974-3979.
[2] Vannini A, Volpari C, Gargioli C, et al. The crystal structure of the quorum sensing protein TraR bound to its autoinducer and target DNA[J]. The EMBO journal, 2002, 21(17): 4393-4401.
[3] Zhang R, Pappas T, Brace J L, et al. Structure of a bacterial quorum-sensing transcription factor complexed with pheromone and DNA[J]. Nature, 2002, 417(6892): 971-974.
[4] Nishiguchi M K, Nair V S. Evolution of symbiosis in the Vibrionaceae: a combined approach using molecules and physiology[J]. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2003, 53(6): 2019-2026.
[5] Collins C H, Arnold F H, Leadbetter J R. Directed evolution of Vibrio fischeriLuxR for increased sensitivity to a broad spectrum of acyl ‐homoserine lactones[J]. Molecular microbiology, 2005, 55(3): 712-723.
[6] Sayut D J, Niu Y , Sun L. Construction and engineering of positive feedback loops[J]. ACS chemical biology, 2006, 1(11): 692-696.
[7] 郑世超, 罗瑛, 鲁涛. LuxR家族调控蛋白的结构及功能[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2010, 22(9).
[8] 陈林, 杨亮, 段康民. 从进化谈细菌细胞间的群体感应信号传递[J]. 遗传, 2012, 34(1): 33-40.
[9] 周燚, 刘小锦, 朱晨光, 等. 细菌中群体感应调节系统[J]. 微生物学报, 2004, 44(1): 122-126.
[10] 郭嘉亮, 陈卫民. 细菌群体感应信号分子与抑制剂研究进展[J]. 生命科学, 2007, 2.
LuxR 蛋白家族的蛋白结构分析与改造设计
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（山东大学生命科学学院，济南，250100）
摘要：LuxR 家族调控蛋白是一类在革兰氏阴性细菌群体感应中起重要作用的调控蛋白，它们参与由酰基高丝氨酸内酯（AHL ）介导的多种生物学过程，调控细菌生物发光、质粒转移、生物膜形成以及多种胞外酶、毒力因子和次生代谢产物的合成。在代谢工程和合成生物学中，对LuxR 蛋白进行改造来改变LuxR 与AHL 的结合活性，从而调控代谢流，具有重大意义。本文以TraR 为例，对其结构和功能域进行了分析，回顾了此领域定向进化的工作，并提出了理性设计的蛋白质改造策略，期望构建具有不同结合活性的LuxR 蛋白。 关键词：群体感应LuxR 蛋白质工程
一、 群体感应
细胞与细胞之间信息交流一般被认为只在多细胞生物中发生，而细菌往往被纯粹地看作单细胞生物。在20世纪60年代一种海洋费氏弧菌（Vibrio fischeri）的发光现象引起了科学家的兴趣，Nealson 等在1970年首次报道了该菌菌体密度与生物发光呈正相关，该发光现象受细菌本身的群体感应调节系统（Quorum-Sensing System，QS ）所控制。
细菌根据特定信号分子的浓度可以监测周围环境中自身或其它细菌的数量变化，当信号达到一定的浓度阈值时，能启动菌体中相关基因的表达来适应环境中的变化，这一调控系统被称为细菌的群体感应调节系统。该系统首先由酶催化合成信号分子（自体诱导分子，autoinducer ，AI ，也称信息素pheromon) ，信号分子经扩散或转运系统到达胞外，当累计到一定浓度后，能被位于膜上的感应系统识别，进而引起受体蛋白的构象或基团变化，最终激活靶基因的表达，该表达产物能使细菌适应外界环境各种变化。
不同菌体QS 系统利用不同的信号分子来调控基因的表达。革兰氏阴性（G-）细菌一般利用酰基高丝氨酸环内酯类物质（AHL ）、革兰氏阳性（G+）细菌利用寡肽类（AIP ）信号感知自身种群数量；另外还有一类信号分子是呋喃酰硼酸二酯（AI-2），在G+ 与G- 细菌中均存在，它可感知其它种间细菌数量来调控自身行为。
我们以费氏弧菌为例介绍在G-菌QS 系统中LuxR 蛋白的功能（如图1）。首先，LuxI 基因编码的蛋白酶会催化AHL 小分子的形成，随着细胞密度的增大，AHL 的密度增大，AHL 可以和LuxR 蛋白结合使LuxR 蛋白具有与DNA 结合的能力，LuxR 复合物能激活PluxR 启动子
增强下游包括LuxR 及荧光相关蛋白的表达，从而使成群的费氏弧菌发出荧光。
在合成生物学中，我们把LuxR 基因、PluxR 启动子、AHL 等基因重新组装，来同步不同细胞的生理状态，而LuxR 与AHL 结合活性会深刻影着AHL 的阈值。如果能够设计出更灵敏或者更迟钝的LuxR 蛋白的基因，就可以根据需要利用群感系统在合适的生理状态同步表达基因。
图1费氏弧菌群体感应相关基因
二、 LuxR 蛋白的结构分析
从NCBI 中可以得到费氏弧菌LuxR 的蛋白质序列如下：
>gi|37223202|gb|AAQ90196.1| LuxR [Vibrio fischeri ES114]
MNIKNINANEKIIDKIKTCNNNKDINQCLSEIAKIIHCEYYLFAIIYPHSIIKPDVSIIDNYPEKWRKYY DDAGLLEYDPVVDYSKSHHSPINWNVFEKKTIKKESPNVIKEAQESGLITGFSFPIHTASNGFGMLSFAH SDKDIYTDSLFLHASTNVPLMLPSLVDNYQKINTTRKKSDSILTKREKECLAWASEGKSTWDISKILGCS ERTVTFHLTNTQMKLNTTNR
另外，农杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 中TraR 是LuxR 家族的另一著名蛋白，NCBI 中找到它的序列为
>gi|190014846|ref|YP_001967610.1| TraR [Agrobacterium tumefaciens]
MQHWLDKLTDLAAIEGDECILKTGLADIAEHYGFTGYAYLHIQHRHITAVTNYHREWQSTYFDKKLVALD PVVKRARSRKHIFTWSGEQERPSLSRDERSFYARAADFGIRSGITIPIRTANGSMSMFTLASDKPVIDLD REIDAVAAASTIGQIHARISYLRTTPTAEDAAWLDPKEASYLRWIAVGMTMEEIADVEGVKYNSVRVKLR EAMKRFDVHSKAHMIALAIRRKLI
二者在序列上相似度小于20%，用muscle3.8.31_i86win32进行简单粗糙比对，结果如图2，可以看出一级序列差别很大。但是，二者的蛋白立体结构是非常相似的。
图2 muscle 多序列比对结果
在1990年的时候，科学界就通过突变方式确定了LuxR 蛋白C 端与DNA 结合的区域以及N 端与AHL 结合的区域。在2002年，TraR 的晶体结构被解析出来，在pdb 库中是1H0M 和1L3L ，图2是1L3L 的结构图。
图3 1L3L在spbviwer 中显示的条带结构图
在此之前，人们已经通过突变体和blast 同源蛋白家族等手段分析出了LuxR 相关的保守活性位点及功能区域（如图4）。
图4TraR 中的二级结构、功能域及保守位点分析
结构与功能关系上，LuxR 蛋白N 端为信号分子AHL 的结合区域，占整个蛋白的三分之二；C 端含有保守的螺旋-转角-螺旋(helix-turnhelix,HTH)结构，能够与目的基因特异结合。
对根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens) 中TraR 的结构分析表明，它具有AHL 结合区域(图5) 。此区域由相连的五个反向平行的b 片层折叠与三个a 螺旋组成。AHL 通过四个氢键与TraR 蛋白结合，这四个氢键分别在AHL 的3-酮基基团和水分子(图5①) 、Tyr53 和1- 酮基基团(图5 ②) 、AHL 的酮基环和残基Trp57(图5 ③) 和残基Asp70 和亚氨基团之间(图5 ④) 。其中Thr129 和Ala38 用来稳定第一个氢键(图5 ①) 。在与AHL 形成氢键的氨基酸残基中，Trp57 和Asp70 在LuxR 型蛋白家族中严格保守。AHL 的酰胺侧链与b 片层折叠平行，通过疏水作用与Leu40、Thr51、Tyr53、Tyr61、Phe62、Val72、Trp85 和Ile110 作用进一步稳定。在这些与酰胺侧链相互作用的氨基酸残基中，由于酰胺侧链长度的可变性和LuxR 家族蛋白的多样性，只有Tyr61 和Trp85 严格保守。在TraR 中，Phe62 主要负责酰胺侧链末端与配体结合后的封闭作用，所以AHL 能够不可逆地与TraR 结合。而在其他的LuxR 型蛋白中Phe62 不保守，且在相应的位置比Phe 所占空间小，导致AHL 结合位点打开，所以AHL 与其他LuxR 蛋白的结合是可逆的。
前面QS 系统的介绍中，我们知道，LuxR 家族蛋白大部分为激活子，LuxR 蛋白与DNA 作用会诱导RNA 聚合酶与目的基因启动子结合，进而启动转录。我们很容易理解，在这一过程中，AHL 与LuxR 蛋白的结合是LuxR 与目的基因结合的先决条件，如果没有AHL ，N 端会遮盖C 端的DNA 结合域，干扰DNA 与LuxR 结合；如果AHL 存在，就会促使LuxR 的DNA 结合域暴露，但是AHL 与LuxR 蛋白的结合是如何导致C 端构象变化的还有待进一步研究。
图5TraR 与AHLs 的结合区域
AHL 与TraR 结合形成氢键的简图。虚线框中的分子式为AHLs
的基本结构，①②③④为AHLs 与TraR 蛋白结合的四个氢键。
三、 LuxR 蛋白的定向进化
为了能够使LuxR 可以敏锐地探测到更低浓度的AHL 变化，我们可以通过定向进化的方法得到想要得到的LuxR 蛋白。基本思路如图6。通过这个策略，我们能够将LuxR 的敏感度由最初的1000nm 提升到10nm 。我们可以构建一个正反馈（PFL1）以及增加拷贝数加强LuxR 的表达量（PPL2）来提高敏感度，在此基础上，我们可以利用易错PCR 突变luxR 来获得突变体库，依据UV 激发下表达荧光的时间先后来定义或筛选LuxR 蛋白。现在如果重复论文中的实验，易错PCR 可以很容易购买到相关的kit ，并不需要自己调配体系；以质粒上LuxR 基因两端设计两对引物，采用Gibson 组装的方法可以取代传统的酶切连接，提高效率。当然，缺乏高通量的筛选策略，这依旧不是一件简单的事情。
图6正反馈和定向进化的策略
在得到一系列期望的敏感突变后，我们可以用shuffling 的方法将突变位点进行整合，以得到更加灵敏的突变体。
图7易错PCR 及DNA 重排
四、 LuxR 蛋白的理性设计
虽然没有搜到费氏弧菌中LuxR 蛋白的结构资料，但是我们对其同源蛋白Trar 的背景十
分了解。可以以此为依据理性设计LuxR ，改变它的结合活性。我们对TraR 结合DNA 及AHL 的机制了解地比较清楚，但TraR 结合AHL 后构型改变的变化机制并不清楚，我们可以去改造LuxR 与AHL 结合的部位。
除了已有的结构知识，一些单核苷酸或多核苷酸突变的分析数据（表1、表2）也可以为我们的理性设计提供参考。
表格1单核苷酸位点突变对LuxR 结合活性的影响
表格2多核苷酸位点突变对LuxR 结合活性的影响
但实际上，我们即使拥有了如此丰富的背景资料，理性设计LuxR 蛋白还是非常困难的，即使设计出对定点突变的方案，也是需要筛选的。一个可选的方案是，用计算机模拟突变，然后分子动力学模拟构型变化，比较前后的结构变化，但这也需要时间和硬件成本，况且并不可靠。目前来看，定向进化还是主要的选择。
参考文献：
[1] Slock J, VanRiet D, Kolibachuk D, et al. Critical regions of the Vibrio fischeriluxR protein defined by mutational analysis[J]. Journal of bacteriology, 1990, 172(7): 3974-3979.
[2] Vannini A, Volpari C, Gargioli C, et al. The crystal structure of the quorum sensing protein TraR bound to its autoinducer and target DNA[J]. The EMBO journal, 2002, 21(17): 4393-4401.
[3] Zhang R, Pappas T, Brace J L, et al. Structure of a bacterial quorum-sensing transcription factor complexed with pheromone and DNA[J]. Nature, 2002, 417(6892): 971-974.
[4] Nishiguchi M K, Nair V S. Evolution of symbiosis in the Vibrionaceae: a combined approach using molecules and physiology[J]. International journal of systematic and evolutionary microbiology, 2003, 53(6): 2019-2026.
[5] Collins C H, Arnold F H, Leadbetter J R. Directed evolution of Vibrio fischeriLuxR for increased sensitivity to a broad spectrum of acyl ‐homoserine lactones[J]. Molecular microbiology, 2005, 55(3): 712-723.
[6] Sayut D J, Niu Y , Sun L. Construction and engineering of positive feedback loops[J]. ACS chemical biology, 2006, 1(11): 692-696.
[7] 郑世超, 罗瑛, 鲁涛. LuxR家族调控蛋白的结构及功能[J]. Chinese Bulletin of Life Sciences, 2010, 22(9).
[8] 陈林, 杨亮, 段康民. 从进化谈细菌细胞间的群体感应信号传递[J]. 遗传, 2012, 34(1): 33-40.
[9] 周燚, 刘小锦, 朱晨光, 等. 细菌中群体感应调节系统[J]. 微生物学报, 2004, 44(1): 122-126.
[10] 郭嘉亮, 陈卫民. 细菌群体感应信号分子与抑制剂研究进展[J]. 生命科学, 2007, 2.