现代食品科技
Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.1
一株抗真菌的解淀粉芽孢杆菌的鉴定及其抗菌性研究
陈成，崔堂兵，于平儒
（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）
摘要：本实验室从广州地区土壤中分离得到一株产抗真菌物质的菌株HN06。经检测其对黑曲霉(Aspergillus niger)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和苦瓜枯萎病菌(cucurbit wilt)均有良好的抑制作用。经生理生化实验及16S rDNA同源性序列分析，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。并对其产生的抗真菌物质的部分性质进行了研究。
关键词：抗真菌；解淀粉芽孢杆菌；鉴定 文章篇号：1673-9078(2011)1-36-39
Identification of an Anti-fungal Strain of Amyloliquefaciens Bacillus and
the Properties of the Antifungal Substance
CHEN Cheng, CUI Tang-bing, YU Ping-ru
(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)
Abstract: A bacterial strain HN06 with anti-fungal effect was isolated from the soil in Guangzhou. This stain showed high inhibitory effects on Aspergillus niger, Magnaporthe oryzae, Rhizoctonia solani and Cucurbit wilt. It was identified as Bacillus amyloliquefaciens by physiological-biochemical properties and phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence. And the properties of the antifungal substance produced by HN06 were also studied.
Key words: anti-fungal; amyloliquefaciens bacillus; identification
据联合国粮农组织(FAO)统计，每年因植物遭受病害造成的平均减产量为总产量的10%~15%[1]，而植物病害主要是由真菌引起的。目前抑制真菌对植物病害的方法主要化学农药。但是由于其对人类健康的危害、环境的污染和植物病原菌抗性的产生等问题，使得寻找广谱、高效、低毒的生物农药成为必然。自1945
[2]
年Johnson等报道枯草芽孢杆菌产生抗菌物质后，各种微生物产生的抗菌物质便引起了广泛关注。芽孢杆菌是自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，能产生多种抗菌物质，其中大部分是多肽，主要抑制革兰氏阳性菌；有些还能抑制革兰氏阴性菌、霉菌和酵母[3]
。解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，在近年来的报道中其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，据报道这些代谢产物具有抑制真菌和细菌的活性[4]。
拮抗细菌HN06是本实验室从土壤中分离获得，对多种植物病原真菌有较强的抑制作用，有良好的应用前景。本研究通过生理生化特征和16S rDNA序列
收稿日期：2010-08-13
基金项目：广东省科技攻关资助项目(2009B020310006)
作者简介：陈成（1985-），男，硕士研究生，主要从事酶工程的研究
分析，对该菌株进行鉴定。并对HN06产生的抗真菌
物质的特性进行了初步研究。 1 材料与方法
1.1 菌种
指示菌为黑曲霉(Aspergillus niger)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、冬瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)和苦瓜枯萎病菌(cucurbit wilt)，均为本实验室保藏。拮抗菌HN06由本实验室分离及保藏。 1.2 培养基
NYD培养基：牛肉浸膏8.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，葡萄糖1.0 g/L，调至pH 7.0。
PDA培养基：新鲜马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，调至pH 7.0。
LB培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂2%，调至pH 7.0。 1.3 HN06抗菌物质抗菌谱的测定
抗真菌物质的获得：将HN06菌株适量接种于NYD液体培养基，在温度30 ℃、摇床转速180 r/min的条件下培养48 h。然后在温度4 ℃、转速5000 r/min
36
的条件下离心20 min。取离心上清液，用0.22 μm的滤器过滤后，取滤液进行抗真菌实验。
指示菌菌悬液的制备：分别取水稻纹枯病等致病菌一环，接入5 mL无菌水中，振荡12 h，制成菌悬液。
抗真菌活性的测定：采用牛津杯检测法。将指示菌菌悬液100 μL均匀涂布于固体PDA平板表面，待培养基表面干后放入灭菌的牛津杯，向杯中分别加入100 μL待测样品，然后将培养皿于30 ℃培养箱中培养3 d后，观察抑菌圈的有无并测量其直径大小[5]。 1.4 菌株生理生化特性分析
观察菌落的形态、大小、边缘、表面、凹凸度、透明度；革兰氏染色及芽孢染色观察菌株形态。具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[6]。 1.5 16S rRNA基因序列分析
以细菌基因组DNA为模板，选择细菌16S rRNA基因特异性引物P16sF1：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3’(与16S rRNA 5‘端匹配)，P16sB1：5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT CAC CCC-3’（与16S rRNA 3’端匹配）。可以扩增出16S rRNA的序列（约1.5 kb）。委托华大基因公司测序。测序完成后，将得到的序列在NCBI上进行BLAST，选取几株具有代表性的菌株，采用clustal软件和MAGA软件的进行多序列同源性分析，并构建系统进化树[7]。
1.6 抗真菌物质的性质研究
1.6.1 温度对抗真菌物质抑菌活性的影响
按照1.3中的方法获得抗真菌物质，取3 mL于具塞试管中，分别置于20 ℃、40 ℃、60 ℃、90 ℃和100 ℃的水浴中，保温30 min。冷却后进行抗真菌效果实验。
1.6.2 pH对抗真菌物质抑菌活性的影响
按照1.3中的方法获得抗真菌物质，取3 mL于具塞试管中，分别调pH到1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0 条件下处理5 h。然后再依次调pH至7.0，用无菌水定容至4 mL，进行抗真菌效果实验。
2 结果与讨论
2.1 抗菌谱的测定
由表1可以看出，HN06产生的抗菌物质除了对冬瓜枯萎病菌没有抑菌作用外，对黑曲霉、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌具有很强的抑菌作用，对苦瓜枯萎病菌也有一定的抑菌作用。
表1 HN06菌株的抗菌谱
Table 1 Antimicrobial spectrum of strain HN06
病原菌Pathogens 抑菌圈直径/mm
黑曲霉(Aspergillus niger) 25 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) 27 水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani) 20 冬瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)
0 苦瓜枯萎病菌(Cucurbit wilt)
10
2.2 形态特征及染色结果
拮抗菌HN06革兰氏染色呈阳性，长杆状，产芽孢，有荚膜，稀疏周生鞭毛。在LB平板上培养24 h后，形成的单菌落类似圆形，边缘不规则，有隆起，表面褶皱，不透明，干燥，菌落呈浅黄色；液体培养静止时有菌膜形成。显微镜下油镜观察，细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，产芽孢，芽孢呈椭圆形，有运动性。
图1 拮抗菌HN06菌落形态
Fig.1 Colony morphology antagonistic of HN06
图2 拮抗菌HN06芽孢染色形态 Fig.2 Spore stain mor-phology of HN06
图3 拮抗菌HN06革兰氏染色形态 Fig.3 Gram stain morphology of HN06
2.3 生理生化特征测定结果
主要生理生化特征见表2。由表2可知，HN06菌株的接触酶、酪朊水解、厌氧生长、明胶水解、淀粉水解、V-P反应和硝酸盐还原均为阳性；酪氨酸水
37
解、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麦芽糖、蔗糖。经观察可知，HN06菌株在pH 5.6条件下生长；5% NaCl下不生长；在50 ℃下不生长。结合HN06菌株的形态特征及染色结果，参照参考文献[6]，判断HN06为芽孢杆菌或类芽孢杆菌属。
表2 拮抗菌HN06的生理生化特征 Table 2 Characteristics of strain HN06 检测项目 特征 检测项目 特征 接触酶 + 硝酸盐还原 + 厌氧生长 + 苯丙氨酸脱氨酶 - D-葡萄糖 + 柠檬酸盐利用 - D-甘露醇 + V-P反应 + 麦芽糖 +
生长pH5.6
+
蔗糖 + 2% NaCl + 酪朊水解 + 5% NaCl - 明胶水解 + 生长温度：5 ℃ - 淀粉水解 + 生长温度：30 ℃ +
酪氨酸水解
-
生长温度：50 ℃
-
2.4 HN06的16S rDNA序列分析
经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下显示的图像如图4，引物扩增出的序列长度约为1.5 kb左右，符合常规的16S rDNA序列长度。测序结果表明，扩增的16S rDNA序列全长1453 bp。
图4 HN06的16S rDNA电泳结果
Fig.4 16S rDNA PCR amplified spectrum of strain HN06
测序结果为：
AGCTCTGTCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGT38
TTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCATGTATAGCGATTTAGCACGG
上述碱基序列在NCBI数据库上Blast，构建的系统进化树如图5。
图5 菌株HN06系统发育进化树
Fig.5 phylogenetic tree based on16S rDNA sequence of Bacillus
由图5可看出，HN06菌株的遗传进化距离与芽孢杆菌属最近，它与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus
amyloliquefaciens）同处于一个最小的分支，与已知菌株Bacillus amyloliquefaciens FZB42的同源性达到99%。综合HN06菌株的形态特征和16S rDNA序列分析，鉴定HN06菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。 2.5 抗菌物质的性质
2.5.1 温度对抗菌物质活性的影响
抗真菌物质在40 ℃以下处理30 min仍保持原有的抑菌活性，当温度提高至60 ℃以上时，其失去抑菌活性。可见温度较低时，抗菌物质的活性较高，而温度过高则影响抗菌物质的活性，结果见图6。
图6 温度对抗菌物质活性的影响
Fig.6 Effect of temperature on the antifungal substances
2.5.2 pH对抗菌物质活性的影响
pH值对抗真菌物质稳定性的影响见图7，在酸性条件下抗菌物质容易失活，pH低于4时，完全失去了抑菌活性，而在中性及碱性（pH在6~10范围）条件下抑菌活性高，当pH在7~8范围内，抑菌活性最高。
图7 pH对抗菌物质活性的影响
Fig.7 Effect of pH on the antifungal substances
3 结论
芽孢杆菌繁殖能力强，有利于工业化生产，对人畜无害，不污染环境。芽孢杆菌产生的抗菌活性物质大多为低分子抗生素以及蛋白或多肽类化合物。对抗
真菌活性物质的研究以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、多黏性芽孢杆菌居多，近年来对解淀粉芽孢杆菌研究逐渐增多，其产抗真菌物质主要有抗真菌蛋白[8]、伊枯草菌素、几丁质酶[9]等。
基于细菌的生理生化特征和16S rDNA序列分析建立的系统进化树，基本确定了HN06为解淀粉芽孢杆菌。微生物之间的拮抗现象早已被认识和广泛应用，从自然界寻找和筛选新的抗菌物质是微生物研究的重要内容。通过对其产生的抗真菌物质性质研究发现，该菌株产生的抗真菌活性物质在pH 5~10的范围内都有活性，在pH 7~8的范围内活性最高，在温度40 ℃以下有较好的抗菌活性。因此，有望将HN06菌株产生的抗菌物质开发成生物农药，在农业生产上具有良好的应用前景。 参考文献
[1] 刘志俊,段渝峰.生物农药新概念新发展[J].农药科学与管
理,2003,24(7):28-32
[2] Maget Dana R, Peypoux F Iturins. A special class of pore
forming lip peptides: biological and hysicochemical properties [J]. Toxicology, 1994, 87: 151-174
[3] 刘静,王军,姚建铭,等.枯草芽孢杆菌JA抗菌物特性的研究
及抗菌肽的分离纯化[J].微生物学报,2004,44(4):511-513 [4] 权春善,王军华,徐洪涛,等.一株抗真菌解淀粉芽孢杆菌的
分离鉴定及其发酵条件的初步研究[J].微生物学报,2006, 46(1):7-12
[5] 崔堂兵,刘煜平,郭勇,等.枯草芽孢杆菌培养生产农用抗真
菌素初步研究[J].广东农业科学,2007,1:51-54
[6] 东秀珠,蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册[M],北京:科学出版
社,2001
[7] Quan C S, Liu Q, Tian W J, et al. Biodegradation of an
endocrine-disrupting chemical, di-2-ethylhexyl phthalate, by Bacillus subtilis No.66 [J]. Appl Microbio Biotech, 2005, 66: 701-710
[8] Kim P I, Chung K C. Production of an antifungal protein for
control of Colletotrichum lagenarium by Bacillus amyloliquefaciens MET0908 [J]. FEMS Microbiology Letters, 2004, 234(1): 177-183
[9] Wang S L, Shih I L, Liang T W, et al. Purification and
characterization of two antifungal chitinases extracellularly produced by Bacillus amyloliquefaciens V656 in a shrimp and crab shell powder medium [J]. J Agric Food Chem, 2002, 50(8): 2241-2248
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现代食品科技
Modern Food Science and Technology 2011, Vol.27, No.1
一株抗真菌的解淀粉芽孢杆菌的鉴定及其抗菌性研究
陈成，崔堂兵，于平儒
（华南理工大学生物科学与工程学院，广东广州 510006）
摘要：本实验室从广州地区土壤中分离得到一株产抗真菌物质的菌株HN06。经检测其对黑曲霉(Aspergillus niger)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)和苦瓜枯萎病菌(cucurbit wilt)均有良好的抑制作用。经生理生化实验及16S rDNA同源性序列分析，鉴定该菌株为解淀粉芽孢杆菌。并对其产生的抗真菌物质的部分性质进行了研究。
关键词：抗真菌；解淀粉芽孢杆菌；鉴定 文章篇号：1673-9078(2011)1-36-39
Identification of an Anti-fungal Strain of Amyloliquefaciens Bacillus and
the Properties of the Antifungal Substance
CHEN Cheng, CUI Tang-bing, YU Ping-ru
(School of Bioscience and Bioengineering, South China University of Technology, Guangzhou 510006, China)
Abstract: A bacterial strain HN06 with anti-fungal effect was isolated from the soil in Guangzhou. This stain showed high inhibitory effects on Aspergillus niger, Magnaporthe oryzae, Rhizoctonia solani and Cucurbit wilt. It was identified as Bacillus amyloliquefaciens by physiological-biochemical properties and phylogenetic analysis of 16S rDNA sequence. And the properties of the antifungal substance produced by HN06 were also studied.
Key words: anti-fungal; amyloliquefaciens bacillus; identification
据联合国粮农组织(FAO)统计，每年因植物遭受病害造成的平均减产量为总产量的10%~15%[1]，而植物病害主要是由真菌引起的。目前抑制真菌对植物病害的方法主要化学农药。但是由于其对人类健康的危害、环境的污染和植物病原菌抗性的产生等问题，使得寻找广谱、高效、低毒的生物农药成为必然。自1945
[2]
年Johnson等报道枯草芽孢杆菌产生抗菌物质后，各种微生物产生的抗菌物质便引起了广泛关注。芽孢杆菌是自然界中广泛存在的一种非致病性细菌，能产生多种抗菌物质，其中大部分是多肽，主要抑制革兰氏阳性菌；有些还能抑制革兰氏阴性菌、霉菌和酵母[3]
。解淀粉芽孢杆菌是一种与枯草芽孢杆菌亲缘性很高的细菌，在近年来的报道中其自身的生长过程中可以产生一系列的代谢产物，据报道这些代谢产物具有抑制真菌和细菌的活性[4]。
拮抗细菌HN06是本实验室从土壤中分离获得，对多种植物病原真菌有较强的抑制作用，有良好的应用前景。本研究通过生理生化特征和16S rDNA序列
收稿日期：2010-08-13
基金项目：广东省科技攻关资助项目(2009B020310006)
作者简介：陈成（1985-），男，硕士研究生，主要从事酶工程的研究
分析，对该菌株进行鉴定。并对HN06产生的抗真菌
物质的特性进行了初步研究。 1 材料与方法
1.1 菌种
指示菌为黑曲霉(Aspergillus niger)、稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae)、水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani)、冬瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)和苦瓜枯萎病菌(cucurbit wilt)，均为本实验室保藏。拮抗菌HN06由本实验室分离及保藏。 1.2 培养基
NYD培养基：牛肉浸膏8.0 g/L，酵母膏5.0 g/L，葡萄糖1.0 g/L，调至pH 7.0。
PDA培养基：新鲜马铃薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，琼脂粉20 g/L，调至pH 7.0。
LB培养基：蛋白胨10 g/L、酵母粉5 g/L、NaCl 10 g/L、琼脂2%，调至pH 7.0。 1.3 HN06抗菌物质抗菌谱的测定
抗真菌物质的获得：将HN06菌株适量接种于NYD液体培养基，在温度30 ℃、摇床转速180 r/min的条件下培养48 h。然后在温度4 ℃、转速5000 r/min
36
的条件下离心20 min。取离心上清液，用0.22 μm的滤器过滤后，取滤液进行抗真菌实验。
指示菌菌悬液的制备：分别取水稻纹枯病等致病菌一环，接入5 mL无菌水中，振荡12 h，制成菌悬液。
抗真菌活性的测定：采用牛津杯检测法。将指示菌菌悬液100 μL均匀涂布于固体PDA平板表面，待培养基表面干后放入灭菌的牛津杯，向杯中分别加入100 μL待测样品，然后将培养皿于30 ℃培养箱中培养3 d后，观察抑菌圈的有无并测量其直径大小[5]。 1.4 菌株生理生化特性分析
观察菌落的形态、大小、边缘、表面、凹凸度、透明度；革兰氏染色及芽孢染色观察菌株形态。具体方法参照《常见细菌系统鉴定手册》[6]。 1.5 16S rRNA基因序列分析
以细菌基因组DNA为模板，选择细菌16S rRNA基因特异性引物P16sF1：5’-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AGA ACG AAC GCT-3’(与16S rRNA 5‘端匹配)，P16sB1：5’-TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT CAC CCC-3’（与16S rRNA 3’端匹配）。可以扩增出16S rRNA的序列（约1.5 kb）。委托华大基因公司测序。测序完成后，将得到的序列在NCBI上进行BLAST，选取几株具有代表性的菌株，采用clustal软件和MAGA软件的进行多序列同源性分析，并构建系统进化树[7]。
1.6 抗真菌物质的性质研究
1.6.1 温度对抗真菌物质抑菌活性的影响
按照1.3中的方法获得抗真菌物质，取3 mL于具塞试管中，分别置于20 ℃、40 ℃、60 ℃、90 ℃和100 ℃的水浴中，保温30 min。冷却后进行抗真菌效果实验。
1.6.2 pH对抗真菌物质抑菌活性的影响
按照1.3中的方法获得抗真菌物质，取3 mL于具塞试管中，分别调pH到1.0、2.0、3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0和10.0 条件下处理5 h。然后再依次调pH至7.0，用无菌水定容至4 mL，进行抗真菌效果实验。
2 结果与讨论
2.1 抗菌谱的测定
由表1可以看出，HN06产生的抗菌物质除了对冬瓜枯萎病菌没有抑菌作用外，对黑曲霉、稻瘟病菌、水稻纹枯病菌具有很强的抑菌作用，对苦瓜枯萎病菌也有一定的抑菌作用。
表1 HN06菌株的抗菌谱
Table 1 Antimicrobial spectrum of strain HN06
病原菌Pathogens 抑菌圈直径/mm
黑曲霉(Aspergillus niger) 25 稻瘟病菌(Magnaporthe oryzae) 27 水稻纹枯病菌(Rhizoctonia solani) 20 冬瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)
0 苦瓜枯萎病菌(Cucurbit wilt)
10
2.2 形态特征及染色结果
拮抗菌HN06革兰氏染色呈阳性，长杆状，产芽孢，有荚膜，稀疏周生鞭毛。在LB平板上培养24 h后，形成的单菌落类似圆形，边缘不规则，有隆起，表面褶皱，不透明，干燥，菌落呈浅黄色；液体培养静止时有菌膜形成。显微镜下油镜观察，细胞呈杆状，革兰氏染色阳性，产芽孢，芽孢呈椭圆形，有运动性。
图1 拮抗菌HN06菌落形态
Fig.1 Colony morphology antagonistic of HN06
图2 拮抗菌HN06芽孢染色形态 Fig.2 Spore stain mor-phology of HN06
图3 拮抗菌HN06革兰氏染色形态 Fig.3 Gram stain morphology of HN06
2.3 生理生化特征测定结果
主要生理生化特征见表2。由表2可知，HN06菌株的接触酶、酪朊水解、厌氧生长、明胶水解、淀粉水解、V-P反应和硝酸盐还原均为阳性；酪氨酸水
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解、苯丙氨酸脱氨酶、吲哚产生、柠檬酸盐利用均为阴性；可利用D-葡萄糖、D-甘露醇、麦芽糖、蔗糖。经观察可知，HN06菌株在pH 5.6条件下生长；5% NaCl下不生长；在50 ℃下不生长。结合HN06菌株的形态特征及染色结果，参照参考文献[6]，判断HN06为芽孢杆菌或类芽孢杆菌属。
表2 拮抗菌HN06的生理生化特征 Table 2 Characteristics of strain HN06 检测项目 特征 检测项目 特征 接触酶 + 硝酸盐还原 + 厌氧生长 + 苯丙氨酸脱氨酶 - D-葡萄糖 + 柠檬酸盐利用 - D-甘露醇 + V-P反应 + 麦芽糖 +
生长pH5.6
+
蔗糖 + 2% NaCl + 酪朊水解 + 5% NaCl - 明胶水解 + 生长温度：5 ℃ - 淀粉水解 + 生长温度：30 ℃ +
酪氨酸水解
-
生长温度：50 ℃
-
2.4 HN06的16S rDNA序列分析
经1%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统下显示的图像如图4，引物扩增出的序列长度约为1.5 kb左右，符合常规的16S rDNA序列长度。测序结果表明，扩增的16S rDNA序列全长1453 bp。
图4 HN06的16S rDNA电泳结果
Fig.4 16S rDNA PCR amplified spectrum of strain HN06
测序结果为：
AGCTCTGTCACCTTCGGCGGCTGGCTCCATAAAGGTTACCTCACCGACTTCGGGTGTTACAAACTCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGT38
TTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTTGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTGCCGCCCTATTTGAACGGCACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAACCTTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTCGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTCTGAACCATGCGGTTCAGACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCGCTAACATCAGGGAGCAAGCTCCCATCTGTCCGCTCGACTGCATGTATAGCGATTTAGCACGG
上述碱基序列在NCBI数据库上Blast，构建的系统进化树如图5。
图5 菌株HN06系统发育进化树
Fig.5 phylogenetic tree based on16S rDNA sequence of Bacillus
由图5可看出，HN06菌株的遗传进化距离与芽孢杆菌属最近，它与解淀粉芽孢杆菌（Bacillus
amyloliquefaciens）同处于一个最小的分支，与已知菌株Bacillus amyloliquefaciens FZB42的同源性达到99%。综合HN06菌株的形态特征和16S rDNA序列分析，鉴定HN06菌株为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。 2.5 抗菌物质的性质
2.5.1 温度对抗菌物质活性的影响
抗真菌物质在40 ℃以下处理30 min仍保持原有的抑菌活性，当温度提高至60 ℃以上时，其失去抑菌活性。可见温度较低时，抗菌物质的活性较高，而温度过高则影响抗菌物质的活性，结果见图6。
图6 温度对抗菌物质活性的影响
Fig.6 Effect of temperature on the antifungal substances
2.5.2 pH对抗菌物质活性的影响
pH值对抗真菌物质稳定性的影响见图7，在酸性条件下抗菌物质容易失活，pH低于4时，完全失去了抑菌活性，而在中性及碱性（pH在6~10范围）条件下抑菌活性高，当pH在7~8范围内，抑菌活性最高。
图7 pH对抗菌物质活性的影响
Fig.7 Effect of pH on the antifungal substances
3 结论
芽孢杆菌繁殖能力强，有利于工业化生产，对人畜无害，不污染环境。芽孢杆菌产生的抗菌活性物质大多为低分子抗生素以及蛋白或多肽类化合物。对抗
真菌活性物质的研究以枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌、多黏性芽孢杆菌居多，近年来对解淀粉芽孢杆菌研究逐渐增多，其产抗真菌物质主要有抗真菌蛋白[8]、伊枯草菌素、几丁质酶[9]等。
基于细菌的生理生化特征和16S rDNA序列分析建立的系统进化树，基本确定了HN06为解淀粉芽孢杆菌。微生物之间的拮抗现象早已被认识和广泛应用，从自然界寻找和筛选新的抗菌物质是微生物研究的重要内容。通过对其产生的抗真菌物质性质研究发现，该菌株产生的抗真菌活性物质在pH 5~10的范围内都有活性，在pH 7~8的范围内活性最高，在温度40 ℃以下有较好的抗菌活性。因此，有望将HN06菌株产生的抗菌物质开发成生物农药，在农业生产上具有良好的应用前景。 参考文献
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