2007年2月
第16卷 第1期中央民族大学学报(自然科学版) Journal of the CUN (Natural Sciences Edition ) Feb . 2007Vol . 16 No . 1植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化的影响
周宜君1, 2, 周生闯, 刘 玉, 张根发112
(1. 中央民族大学生命与环境科学学院, 北京 100081; 2. 北京师范大学生命科学学院, 北京 100875)
摘 要: 植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化过程具有重要作用. 用于愈伤组织诱导与分化的植
物生长调节剂通常为2, 4-D 、NAA 、6-BA 等. 研究结果表明, 同一种植物生长调节剂的不同浓度及不同植物生
长调节剂间的配比对植物愈伤组织的诱导与分化产生重要影响. 本文对几种植物生长调节剂在植物愈伤组
织的诱导与分化过程中的影响作用进行了讨论.
关键词: 植物生长调节剂; 愈伤组织; 诱导; 分化
中图分类号:Q945. 3 文献标识码:A 文章编号:1005-8036(2007) 01-0023-06
优良的愈伤组织通常具有以下特性:(1) 高度的胚性或再分化能力, 以便获得再生植株; (2) 容易散碎, 以便建立优良的悬浮系, 并且在需要时能从中分离出全能性原生质体; (3) 旺盛的自我增殖能力, 以便建立大规模的愈伤组织无性系; (4) 经过长期继代保存而不丧失胚性, 以便有可能对它们进行各种遗传操作. 由于愈伤组织所具有的上述特性, 其诱导与分化在保护植物资源特别是濒危药用植物资源、植物遗传转化等方面发挥极其重要的作用. 业已证明, 在一定外界条件刺激下, 植物细胞表现高度的全能性, 但能否诱导出优良的愈伤组织, 不仅与培养基种类有关, 而且与植物激素和植物生长调节物质种类及配比密切相关. [1]
1 植物愈伤组织的诱导
作为建立再生体系的前提和基础, 愈伤组织的诱导是非常关键的. 愈伤组织的形成过程一般分为三个阶段:诱导期、分裂期和形成期. 大量的研究表明, 几乎所有高等植物的各种器官(如根、茎、叶和花等) 以及各种组织(如皮层、茎髓和形成层等) 离体后在适合条件下都能产生愈伤组织[1]. 愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类, 而是培养条件, 其中植物生长调节剂的种类和浓度最为重要. 诱导愈伤组织的培养基中植物生长调节剂的配比, 一般为生长素类和细胞分裂素类间的配比. 用于诱导愈伤组织的植物生长调节剂有2, 4-D 、6-B A 、KT 、ZT 、NAA 、pCPA 、kin 等
SH 培养基等.
1. 1 2, 4-D 对愈伤组织诱导的作用
2, 4-D 对于愈伤组织的诱导和生长非常有效, 是组织培养中常用的植物生长调节剂. 根据Arm strong 标准将愈伤组织分为3种类型:I 型, 结构致密、复杂多样、生长缓慢, 通过器官发生途径分化芽和根, 产生胚状体较少, 不易长期继代; Ⅱ型, 结构松散、易碎、呈颗粒状、生长较快, 长期继代仍有胚性, 能通过胚状体途径再生, 2, 4-D 浓度为5mg L 时, 形成的愈伤组织多为该类型; Ⅲ型, 结构粘软、水浸状、白色透明或半透明, 容易继代培养, 但几乎丧失分化能力, 为非胚性愈伤组织, 2, 4-D 浓度为8～12mg L 时形成的
收稿日期:2006-10-13
项目资助:中央民族大学985工程项目(cun985-3-3) , 国家自然科学基金资助项目(30670203) , 北京市自然科学基金资助项目(5042012) 作者简介:周宜君(1964-) , 女(满族) , 福建福州人, 中央民族大学副教授, 主要研究方向:植物抗逆机制. [2～3]. 培养基以MS 居多, 也有B 5和
24中央民族大学学报(自然科学版)
[4]第16卷 愈伤组织多为此类. 由此可知, 培养基中2, 4-D 浓度的差异对愈伤组织的诱导和形成类型有重要影
[5～7]响. 2, 4-D 为多种植物愈伤组织的诱导脱分化所必需, 特别是单子叶植物, 如禾本科作物及牧草. 2,
4-D 是禾本科植物组织培养中一种有效的生长素类植物生长调节剂, 在诱导培养基中, 通常添加1-6mg
[1, 8～11]L 2, 4-D 以诱导禾本科植物各种外植体细胞的脱分化, 形成愈伤组织. Bhaskaren 指出, 在禾本科愈
伤组织诱导中, 2, 4-D 通常是起决定作用的植物生长调节剂[12]. Yamaday 等认为2, 4-D 可使花粉改变原来正常的发育途径, 它与染色质的组蛋白结合, 使其脱离DNA 链, 从而活化DNA 链, 导致大量的DNA 复
[13]制, 细胞连续进行分裂, 形成愈伤组织.
单独使用2, 4-D 的培养基对愈伤组织诱导有很好的效果. 解继红等研究证明, 蒙古冰草幼胚在不含2, 4-D 的4种培养基(MS 、1 2MS 、N 6、1 2N 6) 培养时, N 6培养基的幼胚萌发率最高为96%,当培养基中加入2, 4-D 后, 幼胚萌发率骤减, 在接种第4d 便可发生脱分化, 产生愈伤组织, 少量脱分化组织里出现再
[14][15]生芽. 使用B 5+0. 5mg L 2, 4-D 的培养基诱导杜仲幼叶, 其出愈率高达100%,且生长良好.
在诱导植物愈伤组织时, 2, 4-D 也通常与其他植物生长素类或细胞分裂素类物质一起使用, 如闻丽等用2, 4-D 和NAA 成功诱导了油茶的愈伤组织[16]. 丁路明等用2, 4-D 和6-B A 诱导出早熟禾的愈伤组织, 实验证明, 在配合使用2, 4-D 和6-BA 的情况下, 愈伤组织诱导率要高于单独使用2, 4-D , 而且出现淡
[17]黄色、颗粒状愈伤组织的比率也高. 黄双龙等使用MS +1. 0mg L 2, 4-D +0. 5mg L 6-BA 的培养基, 使红
花长寿花的愈伤组织诱导率达到94. 1%[18]. 但不同种类的植物中生长素类和细胞分裂素类的配比对愈伤组织诱导影响较大. 在对多年生黑麦草的愈伤组织诱导中, 生长素类物质的作用比细胞分裂素类更为
[19]重要, 细胞分裂素含量过高时, 对愈伤组织的形成有一定的抑制作用. 2, 4-D 及其与6-B A 配比使用对
部分植物诱导愈伤组织出愈率的结果见表1. 由表1可知, 不同植物、不同植物生长调节剂含量配比的出愈率不同.
表1 2, 4-D 对植物愈伤组织诱导的作用
Tab . 1 The effects of 2, 4_D on induction of plant callus
培养基配比
B 5+0. 5mg L 2, 4-D
1 2MS +(0. 5-10mg L ) 2, 4-D
MS +2. 0mg L 2, 4-D
MS +0. 1mg L 2, 4-D +0. 1mg L 6-BA
M S +0. 5mg L 2, 4-D +0. 1mg L 6-BA
M S +0. 5mg L 2, 4-D +0. 2mg L 6-BA
M S +0. 5mg L 2, 4-D +3. 0mg L 6-BA
M S +1. 0mg L 2, 4-D +0. 5mg L 6-BA 材料杜仲叶片杉木合子胚蒙古冰草幼胚驱蚊香草杜仲叶片油茶花药萝卜子叶红花长寿花叶片
[20]出愈率(%) [1**********]60. 5342. 7460. 8794. 1尽管较高浓度的2, 4-D 有利于胚性愈伤组织的诱导, 但一定程度上2, 4-D 也是促使愈伤组织褐化
的一个因素, 与不加任何激素的MS 培养基相比, 单独添加2, 4-D 时, I AA 氧化酶和细胞分裂素氧化酶的活性明显降低, 从而影响愈伤组织的正常生长和分化; 另一方面, 由于培养基中2, 4-D 的存在, 致使整个培养系统的生长调节物质比例始终处于高比例的生长素类似物状态, 这可能是导致愈伤组织褐化和水
[21]化的重要原因. 此外也有研究表明, 培养基中高浓度的生长素会诱导愈伤组织内多酚氧化酶活性升
高, 从而导致愈伤组织褐化
[23][22]. 研究者认为, 2, 4-D 虽然可以起到诱导作用, 但对外植体及愈伤组织的伤[24]害作用较大, 故诱导时所采取的浓度不宜过大, 以减少组织培养中的无性系变异
度通常为0. 5～12mg L .
1. 2 NAA 对愈伤组织诱导的作用. 2, 4-D 的使用浓
在植物愈伤组织的诱导中, 虽然对NAA 的利用不是很多, 但NAA 对愈伤组织的诱导也有很重要的作用. 林娅等研究表明, NAA 诱导愈伤组织的效果优于2, 4-D , NAA 与任何一种细胞分裂素类物质结合
[25]使用, 愈伤组织诱导率都为100%. 龙雯虹等对萝卜愈伤组织的诱导研究也指出, 不同的生长素类物, [26],
第1期周宜君等:植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化的影响
[27]25的诱导效果不同, 对芦荟的诱导效果为6-BA >IB A >2, 4-D >NAA
组织诱导也取得了100%的诱导率
用
织[28～30][31][16]. 单独使用NAA , 对杜仲幼叶的愈伤[13, 16]. NAA 和2, 4-D 的配比使用以及NAA 和6-B A 的配比使, 对植物愈伤组织的诱导效果也很好. 用MS +NAA +6-B A +KT 培养基, 成功诱导了甜瓜愈伤组
[32]. 在诱导植物愈伤组织时, NAA 的使用浓度范围一般为0. 05～20mg L . 实验证明, 在普通烟草髓愈伤组织的培养过程中, 外源NAA 可促进内源IAA 的合成. 而内源IAA
[33]含量的增加有利于水稻胚性愈伤组织的形成. NAA 及其与6-BA 配比使用对部分植物诱导愈伤组织
出愈率的结果见表2. 由表2可知, 不同植物、不同植物生长调节剂含量配比的出愈率不同.
表2 NAA 对植物愈伤组织诱导的作用
Tab . 2 The effects of NAA on induction of plant callus
培养基配比
B5+0. 5-1. 0mg L NAA
LS +0. 2mg L NAA +0. 5mg L 6-BA
MS +0. 1mg L NAA +2. 0mg L 6-BA
MS +0. 5mg L NAA +2. 0mg L 6-BA
MS +0. 5mg L NAA +3. 0mg L 6-BA
MS +1. 0mg L NAA +0. 5mg L 6-BA
MS +0. 05mg L NAA +0. 6mg L 2, 4-D
MS +15mg L NA A +8%食用糖材料杜仲叶片盐桦茎段红花长寿花叶片驱蚊香草萝卜种子杜仲叶片油茶花药脱毒马铃薯出愈率(%) 1008215. 155. 810010035. 56100
1. 3 其他植物生长调节剂对愈伤组织诱导的作用
从上述2, 4-D 、NAA 对愈伤组织诱导影响作用的讨论中可以看出6-B A 在植物愈伤组织诱导过程中的作用. 闻丽等指出, 影响油茶花药愈伤组织诱导率的主导因子为6-B A , 而2, 4-D 为次要因子. 低浓度的6-B A 水平(0. 1mg L ) 下, 愈伤组织诱导率变化趋势随2, 4-D 浓度的递增而增加; 高浓度的6-B A 水平(0. 2mg L ) 下, 愈伤组织诱导率变化趋势随2, 4-D 浓度的递增而减少
的结论一致[19][17]. 说明高水平的6-BA 与2, 4-D 的相互作用, 可使2, 4-D 的诱导作用受到抑制. 这与用6-BA 与2, 4-D 配比对黑麦草的愈伤组织诱导研究.
[16]研究表明, 6-B A +IBA 的组合可明显促进愈伤组织的诱导和生长, 并且适合进一步继代培养
I AA 的培养基使金边瑞香的愈伤组织诱导率达85. 0%[34]. 6-BA 与I AA 的组合也能使愈伤组织的诱导达到一个较高的水平, 如使用MS +2. 0mg L 6-B A +0. 1mg L . 笔者选用MS +0. 5mg L 6-BA +0. 0025mg L
[35]I AA 的培养基, 使好好芭(Jojoba ) 的愈伤组织诱导率达到了100%.焦海华等在MS +ZT 培养基上诱导出效果较好的一品红愈伤组织. 在愈伤组织继代培养基中附
[16]加低浓度的BAP (6-苄氨基嘌呤) , 可以改善蒙古冰草的愈伤状态, 提高胚性愈伤组织诱导能力
培养基上加入KT 时, 对愈伤组织的诱导及生长起抑制作用[16]. 在B 5+IB A 的培养基上成功诱导了杜仲的愈伤组织, 在含适宜浓度生长素类物质(IB A 、2, 4-D 和NAA ) 的B 5. 陈军营等[36]的研究表明, 添加0. 1mg /L AB A 的小麦愈伤组织诱导培养基, 以及在此基础上再添加2. 5mg /L 或5. 0mg /L AgNO 3的诱导培养基对幼胚愈伤组织形成和分化最为有利.
噻二唑苯基脲(Thidiazuron , TDZ ) 在许多植物组织培养中具有明显的植物生长调节剂作用, 尤其是对于木本植物具有突出效果[37]. TDZ 能够显著促进桑树愈伤组织的产生和生长
[39][38]. Capelle 等研究表明, TDZ 诱导利马豆愈伤组织生长的速率是其他植物生长调节剂的30倍.
2 愈伤组织的分化
在组织培养中, 通过器官发生途径产生再生植株的基本方式一般有3种:(1) 先分化芽, 待芽伸长后, 2,
26中央民族大学学报(自然科学版) 第16卷 产生不定芽而形成完整植株. (3) 在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根, 然后二者的维管组织互相连接, 成为具有统一的轴状结构的小植株. 在培养基中如果存在腺嘌呤或激动素, 就会促进芽的分化和发育, 激动素的效力比腺嘌呤大3万倍. 在结合使用I AA (或NAA ) 和B A (或KT ) 时, 若IAA (或NAA ) 的相对浓度较高, 则有利于细胞的增殖和根的分化, 若B A (或KT ) 的相对浓度较高, 则促进芽的分化, 当比例适
[1]中时, 则仍产生无分化的愈伤组织.
2. 1 2, 4-D 对愈伤组织分化的作用
一般认为高浓度的2, 4-D 对愈伤组织的诱导分化是不利的, 在诱导脱分化后必须及时降低或去掉, 胚性细胞才能正常发育[5]. 高浓度的2, 4-D 对愈伤组织的分化不利, 原因可能是2, 4-D 浓度高, 消耗慢, 长时间作用于愈伤组织, 导致分化率降低. 唐宗祥等认为, KT 能够在一定程度上拮抗高浓度2, 4-D 对愈伤组织分化的抑制作用. 2, 4-D 可以开启有关细胞分裂的基因, 使细胞分裂增殖, 但同时抑制了有关分化的基因的表达, 而KT 使细胞分裂的同时, 主要是促进有关分化基因的表达, 使细胞朝着分化为器官
[40]的方向发展. 但也有研究者用2, 4-D 成功诱导了愈伤组织的分化, 焦海华等用MS +ZT +2, 4-D , 使一
品红愈伤组织的芽分化率达到86. 6%
2. 2 6-B A 对愈伤组织分化的作用
6-B A 是对植物愈伤组织分化中的重要植物生长调节剂. 单独使用6-BA 可使植物愈伤组织得以分化, 使用1 3MS +3. 0mg L 6-B A 的培养基, 使欧李愈伤组织的分化率达到42%
[31][41][35]. . 与愈伤组织诱导相同, 在诱导植物愈伤组织分化时, 6-BA 通常与其他植物生长调节剂配合使用. 用MS +6-B A +NAA +IAA +KT 诱导了甜瓜花药愈伤组织的分化, 用MS +6-BA +ZT 诱导了金边瑞香花
[34][41]瓣的愈伤组织的分化, 用1 3MS +BA +IB A 使欧李愈伤组织得以分化, 用DCR (或GD ) +6-BA +
KT +NAA 诱导了杉木合子胚愈伤组织的分化
成芽数量和长势则有降低的趋势[29][42]. 6-B A 浓度的增加与分化率并不成线性关系. 研究表明, 盐桦愈伤组织的最佳分化抽枝培养基为LS +0. 5mg L 6-B A +0. 02mg L NAA , 随着6-B A 浓度的升高, . 6-B A 及其与其他植物生长调节剂配比对部分植物愈伤组织分化率的影响结果见表3. 由表3可知, 同一植物同一植物生长调节剂不同含量、不同植物不同植物生长调节剂配比的愈伤分化率皆不相同.
2. 3 愈伤分化中的基因控制
植物激素和植物生长调节剂作为第一信使, 通过各种信号系统调节基因活性、启动基因表达而发挥作用. 植物愈伤组织的器官发生是细胞顺序启动基因的表达过程, 这一过程中与器官发生有关的基因不断表达, 产生相应的蛋白[43]. 愈伤组织中表达蛋白的多少可反映其组织化和分化的程度, 表达的蛋白
[44]少, 表明该愈伤组织的分化或组织化程度低, 具有较强的分生能力或器官发生能力
发现一组多肽(20-25kDa ) 与子叶器官发生密切相关[45]. 在甜瓜子叶中已
[46]; 在大麦胚和根脱分化诱导愈伤组织形成时发. 谷瑞升等在胡
[44]现有32个蛋白是特异产生的, 其中一些蛋白可以作为脱分化和细胞发育的分子标记杨愈伤组织器官发生过程中, 也发现了两个具有较强器官发生能力的茎基愈伤组织的特征蛋白. 另
外, Noboru 等研究发现, 愈伤组织中正常细胞的多少直接影响其分化与再生能力, 染色体变异程度越大, 分化频率越低[47].
表3 6-BA 对愈伤组织分化的影响
Tab . 3 The effects of 2, 4_D on differentiation of plant callus
培养基配比材料
欧李
欧李
盐桦
红花长寿花
红花长寿花
金边瑞香愈伤分化率(%) 423810059. 4093. 7597. 51 3MS +3. 0mg L 6-BA 1 3MS +2. 0mg L 6-BA LS +0. 5mg L 6-BA +0. 02mg L NA A M S +0. 5mg L 6-BA +0. 25mg L NAA +0. 6mg L GA M S +1. 5mg L 6-BA +0. 25mg L NAA +0. 6mg L GA MS +0. 1mg L 6-BA +1. 0mg L ZT
第1期周宜君等:植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化的影响27
上述的讨论表明, 植物生长调节剂是植物愈伤组织诱导和分化的重要因素之一. 尽管其作用特点已知, 但由于植物物种的差异, 植物生长调节剂种类、剂量的选择以及不同植物生长调节剂间的配比的选择是探讨高效率进行植物愈伤组织诱导和分化的关键所在.
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Influences of Plant Growth Regulations
on Induction and Differentiation of Plant Callus
ZHOU Yi -jun 1, 2, ZHOU Sheng -chuang , LIU Yu , ZHANG Gen -fa 112
(1. C ollege of Li fe Sc ienc e , Bei jing Nor mal Uni ver sity , Bei jing 100081, C hina ;
2. College of Lif e and Envi ronmental Science , C ent ral Unive rs ity for Nationalities , Bei jing 100875, C hina )
A bstract :The plant gr owth regulators play important roles in induction and differentiation of plant callus . Several kinds of plant growth regulators , such as 2, 4-D , NAA , 6-B A and KT et al . are usually used . It
was shown that the a mount of one plant growth regulator , and the proper proportion a mong the plant
growth regulators , has very influences on the induction and differentiation of plant callus . And the
functions of several kinds of plant growth regulators in the induction and differentiation of plant callus are
also discussed in this article .
Key words :plant gr owth regulators ; callus ; induction ; differentiation
[责任编辑:白 玲]
2007年2月
第16卷 第1期中央民族大学学报(自然科学版) Journal of the CUN (Natural Sciences Edition ) Feb . 2007Vol . 16 No . 1植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化的影响
周宜君1, 2, 周生闯, 刘 玉, 张根发112
(1. 中央民族大学生命与环境科学学院, 北京 100081; 2. 北京师范大学生命科学学院, 北京 100875)
摘 要: 植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化过程具有重要作用. 用于愈伤组织诱导与分化的植
物生长调节剂通常为2, 4-D 、NAA 、6-BA 等. 研究结果表明, 同一种植物生长调节剂的不同浓度及不同植物生
长调节剂间的配比对植物愈伤组织的诱导与分化产生重要影响. 本文对几种植物生长调节剂在植物愈伤组
织的诱导与分化过程中的影响作用进行了讨论.
关键词: 植物生长调节剂; 愈伤组织; 诱导; 分化
中图分类号:Q945. 3 文献标识码:A 文章编号:1005-8036(2007) 01-0023-06
优良的愈伤组织通常具有以下特性:(1) 高度的胚性或再分化能力, 以便获得再生植株; (2) 容易散碎, 以便建立优良的悬浮系, 并且在需要时能从中分离出全能性原生质体; (3) 旺盛的自我增殖能力, 以便建立大规模的愈伤组织无性系; (4) 经过长期继代保存而不丧失胚性, 以便有可能对它们进行各种遗传操作. 由于愈伤组织所具有的上述特性, 其诱导与分化在保护植物资源特别是濒危药用植物资源、植物遗传转化等方面发挥极其重要的作用. 业已证明, 在一定外界条件刺激下, 植物细胞表现高度的全能性, 但能否诱导出优良的愈伤组织, 不仅与培养基种类有关, 而且与植物激素和植物生长调节物质种类及配比密切相关. [1]
1 植物愈伤组织的诱导
作为建立再生体系的前提和基础, 愈伤组织的诱导是非常关键的. 愈伤组织的形成过程一般分为三个阶段:诱导期、分裂期和形成期. 大量的研究表明, 几乎所有高等植物的各种器官(如根、茎、叶和花等) 以及各种组织(如皮层、茎髓和形成层等) 离体后在适合条件下都能产生愈伤组织[1]. 愈伤组织诱导的成败关键主要不是外植体的来源和种类, 而是培养条件, 其中植物生长调节剂的种类和浓度最为重要. 诱导愈伤组织的培养基中植物生长调节剂的配比, 一般为生长素类和细胞分裂素类间的配比. 用于诱导愈伤组织的植物生长调节剂有2, 4-D 、6-B A 、KT 、ZT 、NAA 、pCPA 、kin 等
SH 培养基等.
1. 1 2, 4-D 对愈伤组织诱导的作用
2, 4-D 对于愈伤组织的诱导和生长非常有效, 是组织培养中常用的植物生长调节剂. 根据Arm strong 标准将愈伤组织分为3种类型:I 型, 结构致密、复杂多样、生长缓慢, 通过器官发生途径分化芽和根, 产生胚状体较少, 不易长期继代; Ⅱ型, 结构松散、易碎、呈颗粒状、生长较快, 长期继代仍有胚性, 能通过胚状体途径再生, 2, 4-D 浓度为5mg L 时, 形成的愈伤组织多为该类型; Ⅲ型, 结构粘软、水浸状、白色透明或半透明, 容易继代培养, 但几乎丧失分化能力, 为非胚性愈伤组织, 2, 4-D 浓度为8～12mg L 时形成的
收稿日期:2006-10-13
项目资助:中央民族大学985工程项目(cun985-3-3) , 国家自然科学基金资助项目(30670203) , 北京市自然科学基金资助项目(5042012) 作者简介:周宜君(1964-) , 女(满族) , 福建福州人, 中央民族大学副教授, 主要研究方向:植物抗逆机制. [2～3]. 培养基以MS 居多, 也有B 5和
24中央民族大学学报(自然科学版)
[4]第16卷 愈伤组织多为此类. 由此可知, 培养基中2, 4-D 浓度的差异对愈伤组织的诱导和形成类型有重要影
[5～7]响. 2, 4-D 为多种植物愈伤组织的诱导脱分化所必需, 特别是单子叶植物, 如禾本科作物及牧草. 2,
4-D 是禾本科植物组织培养中一种有效的生长素类植物生长调节剂, 在诱导培养基中, 通常添加1-6mg
[1, 8～11]L 2, 4-D 以诱导禾本科植物各种外植体细胞的脱分化, 形成愈伤组织. Bhaskaren 指出, 在禾本科愈
伤组织诱导中, 2, 4-D 通常是起决定作用的植物生长调节剂[12]. Yamaday 等认为2, 4-D 可使花粉改变原来正常的发育途径, 它与染色质的组蛋白结合, 使其脱离DNA 链, 从而活化DNA 链, 导致大量的DNA 复
[13]制, 细胞连续进行分裂, 形成愈伤组织.
单独使用2, 4-D 的培养基对愈伤组织诱导有很好的效果. 解继红等研究证明, 蒙古冰草幼胚在不含2, 4-D 的4种培养基(MS 、1 2MS 、N 6、1 2N 6) 培养时, N 6培养基的幼胚萌发率最高为96%,当培养基中加入2, 4-D 后, 幼胚萌发率骤减, 在接种第4d 便可发生脱分化, 产生愈伤组织, 少量脱分化组织里出现再
[14][15]生芽. 使用B 5+0. 5mg L 2, 4-D 的培养基诱导杜仲幼叶, 其出愈率高达100%,且生长良好.
在诱导植物愈伤组织时, 2, 4-D 也通常与其他植物生长素类或细胞分裂素类物质一起使用, 如闻丽等用2, 4-D 和NAA 成功诱导了油茶的愈伤组织[16]. 丁路明等用2, 4-D 和6-B A 诱导出早熟禾的愈伤组织, 实验证明, 在配合使用2, 4-D 和6-BA 的情况下, 愈伤组织诱导率要高于单独使用2, 4-D , 而且出现淡
[17]黄色、颗粒状愈伤组织的比率也高. 黄双龙等使用MS +1. 0mg L 2, 4-D +0. 5mg L 6-BA 的培养基, 使红
花长寿花的愈伤组织诱导率达到94. 1%[18]. 但不同种类的植物中生长素类和细胞分裂素类的配比对愈伤组织诱导影响较大. 在对多年生黑麦草的愈伤组织诱导中, 生长素类物质的作用比细胞分裂素类更为
[19]重要, 细胞分裂素含量过高时, 对愈伤组织的形成有一定的抑制作用. 2, 4-D 及其与6-B A 配比使用对
部分植物诱导愈伤组织出愈率的结果见表1. 由表1可知, 不同植物、不同植物生长调节剂含量配比的出愈率不同.
表1 2, 4-D 对植物愈伤组织诱导的作用
Tab . 1 The effects of 2, 4_D on induction of plant callus
培养基配比
B 5+0. 5mg L 2, 4-D
1 2MS +(0. 5-10mg L ) 2, 4-D
MS +2. 0mg L 2, 4-D
MS +0. 1mg L 2, 4-D +0. 1mg L 6-BA
M S +0. 5mg L 2, 4-D +0. 1mg L 6-BA
M S +0. 5mg L 2, 4-D +0. 2mg L 6-BA
M S +0. 5mg L 2, 4-D +3. 0mg L 6-BA
M S +1. 0mg L 2, 4-D +0. 5mg L 6-BA 材料杜仲叶片杉木合子胚蒙古冰草幼胚驱蚊香草杜仲叶片油茶花药萝卜子叶红花长寿花叶片
[20]出愈率(%) [1**********]60. 5342. 7460. 8794. 1尽管较高浓度的2, 4-D 有利于胚性愈伤组织的诱导, 但一定程度上2, 4-D 也是促使愈伤组织褐化
的一个因素, 与不加任何激素的MS 培养基相比, 单独添加2, 4-D 时, I AA 氧化酶和细胞分裂素氧化酶的活性明显降低, 从而影响愈伤组织的正常生长和分化; 另一方面, 由于培养基中2, 4-D 的存在, 致使整个培养系统的生长调节物质比例始终处于高比例的生长素类似物状态, 这可能是导致愈伤组织褐化和水
[21]化的重要原因. 此外也有研究表明, 培养基中高浓度的生长素会诱导愈伤组织内多酚氧化酶活性升
高, 从而导致愈伤组织褐化
[23][22]. 研究者认为, 2, 4-D 虽然可以起到诱导作用, 但对外植体及愈伤组织的伤[24]害作用较大, 故诱导时所采取的浓度不宜过大, 以减少组织培养中的无性系变异
度通常为0. 5～12mg L .
1. 2 NAA 对愈伤组织诱导的作用. 2, 4-D 的使用浓
在植物愈伤组织的诱导中, 虽然对NAA 的利用不是很多, 但NAA 对愈伤组织的诱导也有很重要的作用. 林娅等研究表明, NAA 诱导愈伤组织的效果优于2, 4-D , NAA 与任何一种细胞分裂素类物质结合
[25]使用, 愈伤组织诱导率都为100%. 龙雯虹等对萝卜愈伤组织的诱导研究也指出, 不同的生长素类物, [26],
第1期周宜君等:植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化的影响
[27]25的诱导效果不同, 对芦荟的诱导效果为6-BA >IB A >2, 4-D >NAA
组织诱导也取得了100%的诱导率
用
织[28～30][31][16]. 单独使用NAA , 对杜仲幼叶的愈伤[13, 16]. NAA 和2, 4-D 的配比使用以及NAA 和6-B A 的配比使, 对植物愈伤组织的诱导效果也很好. 用MS +NAA +6-B A +KT 培养基, 成功诱导了甜瓜愈伤组
[32]. 在诱导植物愈伤组织时, NAA 的使用浓度范围一般为0. 05～20mg L . 实验证明, 在普通烟草髓愈伤组织的培养过程中, 外源NAA 可促进内源IAA 的合成. 而内源IAA
[33]含量的增加有利于水稻胚性愈伤组织的形成. NAA 及其与6-BA 配比使用对部分植物诱导愈伤组织
出愈率的结果见表2. 由表2可知, 不同植物、不同植物生长调节剂含量配比的出愈率不同.
表2 NAA 对植物愈伤组织诱导的作用
Tab . 2 The effects of NAA on induction of plant callus
培养基配比
B5+0. 5-1. 0mg L NAA
LS +0. 2mg L NAA +0. 5mg L 6-BA
MS +0. 1mg L NAA +2. 0mg L 6-BA
MS +0. 5mg L NAA +2. 0mg L 6-BA
MS +0. 5mg L NAA +3. 0mg L 6-BA
MS +1. 0mg L NAA +0. 5mg L 6-BA
MS +0. 05mg L NAA +0. 6mg L 2, 4-D
MS +15mg L NA A +8%食用糖材料杜仲叶片盐桦茎段红花长寿花叶片驱蚊香草萝卜种子杜仲叶片油茶花药脱毒马铃薯出愈率(%) 1008215. 155. 810010035. 56100
1. 3 其他植物生长调节剂对愈伤组织诱导的作用
从上述2, 4-D 、NAA 对愈伤组织诱导影响作用的讨论中可以看出6-B A 在植物愈伤组织诱导过程中的作用. 闻丽等指出, 影响油茶花药愈伤组织诱导率的主导因子为6-B A , 而2, 4-D 为次要因子. 低浓度的6-B A 水平(0. 1mg L ) 下, 愈伤组织诱导率变化趋势随2, 4-D 浓度的递增而增加; 高浓度的6-B A 水平(0. 2mg L ) 下, 愈伤组织诱导率变化趋势随2, 4-D 浓度的递增而减少
的结论一致[19][17]. 说明高水平的6-BA 与2, 4-D 的相互作用, 可使2, 4-D 的诱导作用受到抑制. 这与用6-BA 与2, 4-D 配比对黑麦草的愈伤组织诱导研究.
[16]研究表明, 6-B A +IBA 的组合可明显促进愈伤组织的诱导和生长, 并且适合进一步继代培养
I AA 的培养基使金边瑞香的愈伤组织诱导率达85. 0%[34]. 6-BA 与I AA 的组合也能使愈伤组织的诱导达到一个较高的水平, 如使用MS +2. 0mg L 6-B A +0. 1mg L . 笔者选用MS +0. 5mg L 6-BA +0. 0025mg L
[35]I AA 的培养基, 使好好芭(Jojoba ) 的愈伤组织诱导率达到了100%.焦海华等在MS +ZT 培养基上诱导出效果较好的一品红愈伤组织. 在愈伤组织继代培养基中附
[16]加低浓度的BAP (6-苄氨基嘌呤) , 可以改善蒙古冰草的愈伤状态, 提高胚性愈伤组织诱导能力
培养基上加入KT 时, 对愈伤组织的诱导及生长起抑制作用[16]. 在B 5+IB A 的培养基上成功诱导了杜仲的愈伤组织, 在含适宜浓度生长素类物质(IB A 、2, 4-D 和NAA ) 的B 5. 陈军营等[36]的研究表明, 添加0. 1mg /L AB A 的小麦愈伤组织诱导培养基, 以及在此基础上再添加2. 5mg /L 或5. 0mg /L AgNO 3的诱导培养基对幼胚愈伤组织形成和分化最为有利.
噻二唑苯基脲(Thidiazuron , TDZ ) 在许多植物组织培养中具有明显的植物生长调节剂作用, 尤其是对于木本植物具有突出效果[37]. TDZ 能够显著促进桑树愈伤组织的产生和生长
[39][38]. Capelle 等研究表明, TDZ 诱导利马豆愈伤组织生长的速率是其他植物生长调节剂的30倍.
2 愈伤组织的分化
在组织培养中, 通过器官发生途径产生再生植株的基本方式一般有3种:(1) 先分化芽, 待芽伸长后, 2,
26中央民族大学学报(自然科学版) 第16卷 产生不定芽而形成完整植株. (3) 在愈伤组织的不同部位分别形成芽和根, 然后二者的维管组织互相连接, 成为具有统一的轴状结构的小植株. 在培养基中如果存在腺嘌呤或激动素, 就会促进芽的分化和发育, 激动素的效力比腺嘌呤大3万倍. 在结合使用I AA (或NAA ) 和B A (或KT ) 时, 若IAA (或NAA ) 的相对浓度较高, 则有利于细胞的增殖和根的分化, 若B A (或KT ) 的相对浓度较高, 则促进芽的分化, 当比例适
[1]中时, 则仍产生无分化的愈伤组织.
2. 1 2, 4-D 对愈伤组织分化的作用
一般认为高浓度的2, 4-D 对愈伤组织的诱导分化是不利的, 在诱导脱分化后必须及时降低或去掉, 胚性细胞才能正常发育[5]. 高浓度的2, 4-D 对愈伤组织的分化不利, 原因可能是2, 4-D 浓度高, 消耗慢, 长时间作用于愈伤组织, 导致分化率降低. 唐宗祥等认为, KT 能够在一定程度上拮抗高浓度2, 4-D 对愈伤组织分化的抑制作用. 2, 4-D 可以开启有关细胞分裂的基因, 使细胞分裂增殖, 但同时抑制了有关分化的基因的表达, 而KT 使细胞分裂的同时, 主要是促进有关分化基因的表达, 使细胞朝着分化为器官
[40]的方向发展. 但也有研究者用2, 4-D 成功诱导了愈伤组织的分化, 焦海华等用MS +ZT +2, 4-D , 使一
品红愈伤组织的芽分化率达到86. 6%
2. 2 6-B A 对愈伤组织分化的作用
6-B A 是对植物愈伤组织分化中的重要植物生长调节剂. 单独使用6-BA 可使植物愈伤组织得以分化, 使用1 3MS +3. 0mg L 6-B A 的培养基, 使欧李愈伤组织的分化率达到42%
[31][41][35]. . 与愈伤组织诱导相同, 在诱导植物愈伤组织分化时, 6-BA 通常与其他植物生长调节剂配合使用. 用MS +6-B A +NAA +IAA +KT 诱导了甜瓜花药愈伤组织的分化, 用MS +6-BA +ZT 诱导了金边瑞香花
[34][41]瓣的愈伤组织的分化, 用1 3MS +BA +IB A 使欧李愈伤组织得以分化, 用DCR (或GD ) +6-BA +
KT +NAA 诱导了杉木合子胚愈伤组织的分化
成芽数量和长势则有降低的趋势[29][42]. 6-B A 浓度的增加与分化率并不成线性关系. 研究表明, 盐桦愈伤组织的最佳分化抽枝培养基为LS +0. 5mg L 6-B A +0. 02mg L NAA , 随着6-B A 浓度的升高, . 6-B A 及其与其他植物生长调节剂配比对部分植物愈伤组织分化率的影响结果见表3. 由表3可知, 同一植物同一植物生长调节剂不同含量、不同植物不同植物生长调节剂配比的愈伤分化率皆不相同.
2. 3 愈伤分化中的基因控制
植物激素和植物生长调节剂作为第一信使, 通过各种信号系统调节基因活性、启动基因表达而发挥作用. 植物愈伤组织的器官发生是细胞顺序启动基因的表达过程, 这一过程中与器官发生有关的基因不断表达, 产生相应的蛋白[43]. 愈伤组织中表达蛋白的多少可反映其组织化和分化的程度, 表达的蛋白
[44]少, 表明该愈伤组织的分化或组织化程度低, 具有较强的分生能力或器官发生能力
发现一组多肽(20-25kDa ) 与子叶器官发生密切相关[45]. 在甜瓜子叶中已
[46]; 在大麦胚和根脱分化诱导愈伤组织形成时发. 谷瑞升等在胡
[44]现有32个蛋白是特异产生的, 其中一些蛋白可以作为脱分化和细胞发育的分子标记杨愈伤组织器官发生过程中, 也发现了两个具有较强器官发生能力的茎基愈伤组织的特征蛋白. 另
外, Noboru 等研究发现, 愈伤组织中正常细胞的多少直接影响其分化与再生能力, 染色体变异程度越大, 分化频率越低[47].
表3 6-BA 对愈伤组织分化的影响
Tab . 3 The effects of 2, 4_D on differentiation of plant callus
培养基配比材料
欧李
欧李
盐桦
红花长寿花
红花长寿花
金边瑞香愈伤分化率(%) 423810059. 4093. 7597. 51 3MS +3. 0mg L 6-BA 1 3MS +2. 0mg L 6-BA LS +0. 5mg L 6-BA +0. 02mg L NA A M S +0. 5mg L 6-BA +0. 25mg L NAA +0. 6mg L GA M S +1. 5mg L 6-BA +0. 25mg L NAA +0. 6mg L GA MS +0. 1mg L 6-BA +1. 0mg L ZT
第1期周宜君等:植物生长调节剂对植物愈伤组织的诱导与分化的影响27
上述的讨论表明, 植物生长调节剂是植物愈伤组织诱导和分化的重要因素之一. 尽管其作用特点已知, 但由于植物物种的差异, 植物生长调节剂种类、剂量的选择以及不同植物生长调节剂间的配比的选择是探讨高效率进行植物愈伤组织诱导和分化的关键所在.
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Influences of Plant Growth Regulations
on Induction and Differentiation of Plant Callus
ZHOU Yi -jun 1, 2, ZHOU Sheng -chuang , LIU Yu , ZHANG Gen -fa 112
(1. C ollege of Li fe Sc ienc e , Bei jing Nor mal Uni ver sity , Bei jing 100081, C hina ;
2. College of Lif e and Envi ronmental Science , C ent ral Unive rs ity for Nationalities , Bei jing 100875, C hina )
A bstract :The plant gr owth regulators play important roles in induction and differentiation of plant callus . Several kinds of plant growth regulators , such as 2, 4-D , NAA , 6-B A and KT et al . are usually used . It
was shown that the a mount of one plant growth regulator , and the proper proportion a mong the plant
growth regulators , has very influences on the induction and differentiation of plant callus . And the
functions of several kinds of plant growth regulators in the induction and differentiation of plant callus are
also discussed in this article .
Key words :plant gr owth regulators ; callus ; induction ; differentiation
[责任编辑:白 玲]