质粒DNA 的提取，纯化及验证
陈倩倩 学号：[1**********]3
一，实验目的：1，掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。
2，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
二，实验原理：碱变性提取质粒DNA 一般包括三个步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分解和纯化质粒DNA 。
在细菌细胞中，染色体DNA 以双螺旋结构存在，质粒DNA 以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA 和质粒DNA 均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH 值不同。在pH 值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA 的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH 值4．6的KAc(或NaAc) 高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA 可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA 不能复性，而是与不稳定的大分子RNA 、蛋白质一SDS 复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA 分离。溶于上清液的质粒DNA ，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA 与RNA 性质类似，乙醇沉淀DNA 的同时，也伴随着RNA 沉淀，可利用RNase A将RNA 降解。质粒DNA 溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA 。 三，实验仪器试剂和材料：
恒温振荡培养箱， 高温冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml 离心管，不同型号吸头，微量移液管等
菌体：E.coli DH5α受体菌
试剂：LB 培养基，氨苄青霉素，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A 母液，TE 缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，TAE 电泳缓冲液，上样缓冲液。
四，实验步骤及现象 ① 准备灭菌
㈠ LB 培养基20ml/100ml ，50ml/300ml， ㈡ 枪尖：1000μl,200μl,20μl ㈢ 离心管1.5ml/500ml,50ml×2 ㈣ 吸管：10ml
④ 质粒检测
用0.9%的琼脂糖电泳检测：
1， 称重0.28g 琼脂糖，用40ml1×TAE 微波炉加热，制平板 2， 取三微升质检样品与1微升电泳载样液混匀点样电泳1h DNA 纯度还算理想。本实验电泳条带清晰：染色体DNA 的含量很低，说明提取样品的纯度较高；没有开环的DNA ，可能与过程中振荡的剧烈程度，保温时间有一定关系。但是仍有不足之处，蛋白质杂质含量较多，其原因较多，一个是由于我们未用平衡酚去除蛋白质，而是使用了酚、氯仿、异戊醇的混合液，致使蛋白质残留较多。另外，电泳条带中参照物的条带只有六条，
少了两条，可能是由于电泳我们组一共跑出三条带，分别为DNA, 超螺旋Puc19质粒DNA,RNA 。
二，超螺旋状态的pUC19质粒，书上查得其质粒大小2.69Kbp ，与标准的对比由
亮度可知，我们提取的量大体上还不错。
三，对于出现RNA 条带可能的原因是RNase 处理时间不够，而如果是开环的DNA
或染色体DNA 断片则可能是震荡过激烈。
四，而对于染色体DNA 的条带亮度比较暗淡来说，我们组分离掉的染色体还很
成功。
五，点样处有亮带，说明有杂质蛋白质的存在 六，注意事项
一，酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，
应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。
二，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要
快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。
三，溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA 或RNA 分子的碱
基之间，并在300 nm 波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸分子。溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，实验结束后用水彻底冲洗干净。
四，沉淀DNA 通常使用预冷无水乙醇，在低温条件下长时间放置可使DNA 沉淀
完全。除用乙醇沉淀DNA 外，还可使用0．6倍体积的异丙醇，但异丙醇也能将盐等杂质沉淀，所以沉淀需要在常温下进行，并且时间不宜太长(限20 min 内) 。沉淀离心后，需用70％乙醇洗涤，以除去盐类及挥发性较小的异丙醇。
质粒DNA 的提取，纯化及验证
陈倩倩 学号：[1**********]3
一，实验目的：1，掌握碱变性提取法的原理及各种试剂的作用。
2，掌握碱变性法提取质粒DNA 的方法。
二，实验原理：碱变性提取质粒DNA 一般包括三个步骤：培养细菌细胞以扩增质粒；收集和裂解细胞；分解和纯化质粒DNA 。
在细菌细胞中，染色体DNA 以双螺旋结构存在，质粒DNA 以共价闭合环状形式存在。细胞破碎后，染色体DNA 和质粒DNA 均被释放出来，但是两者变性与复性所依赖的溶液pH 值不同。在pH 值高达12．0的碱性溶液中，染色体DNA 的氢键断裂，双螺旋结构解开而变性；共价闭合环状质粒DNA 的大部分氢键断裂，但两条互补链不完全分离。当用pH 值4．6的KAc(或NaAc) 高盐溶液调节碱性溶液至中性时，变性的质粒DNA 可恢复原来的共价闭合环状超螺旋结构而溶解于溶液中；但染色体DNA 不能复性，而是与不稳定的大分子RNA 、蛋白质一SDS 复合物等一起形成缠连的、可见的白色絮状沉淀。这种沉淀通过离心，与复性的溶于溶液的质粒DNA 分离。溶于上清液的质粒DNA ，可用无水乙醇和盐溶液，使之凝聚而形成沉淀。由于DNA 与RNA 性质类似，乙醇沉淀DNA 的同时，也伴随着RNA 沉淀，可利用RNase A将RNA 降解。质粒DNA 溶液中的RNase A以及一些可溶性蛋白，可通过酚／氯仿抽提除去，最后获得纯度较高的质粒DNA 。 三，实验仪器试剂和材料：
恒温振荡培养箱， 高温冷冻离心机，漩涡振荡器，水浴锅，1.5ml 离心管，不同型号吸头，微量移液管等
菌体：E.coli DH5α受体菌
试剂：LB 培养基，氨苄青霉素，溶液Ⅰ，溶液Ⅱ，溶液Ⅲ，RNase A 母液，TE 缓冲液，饱和酚，氯仿/异戊醇混合液，酚/氯仿/异戊醇混合液，预冷无水乙醇，TAE 电泳缓冲液，上样缓冲液。
四，实验步骤及现象 ① 准备灭菌
㈠ LB 培养基20ml/100ml ，50ml/300ml， ㈡ 枪尖：1000μl,200μl,20μl ㈢ 离心管1.5ml/500ml,50ml×2 ㈣ 吸管：10ml
④ 质粒检测
用0.9%的琼脂糖电泳检测：
1， 称重0.28g 琼脂糖，用40ml1×TAE 微波炉加热，制平板 2， 取三微升质检样品与1微升电泳载样液混匀点样电泳1h DNA 纯度还算理想。本实验电泳条带清晰：染色体DNA 的含量很低，说明提取样品的纯度较高；没有开环的DNA ，可能与过程中振荡的剧烈程度，保温时间有一定关系。但是仍有不足之处，蛋白质杂质含量较多，其原因较多，一个是由于我们未用平衡酚去除蛋白质，而是使用了酚、氯仿、异戊醇的混合液，致使蛋白质残留较多。另外，电泳条带中参照物的条带只有六条，
少了两条，可能是由于电泳我们组一共跑出三条带，分别为DNA, 超螺旋Puc19质粒DNA,RNA 。
二，超螺旋状态的pUC19质粒，书上查得其质粒大小2.69Kbp ，与标准的对比由
亮度可知，我们提取的量大体上还不错。
三，对于出现RNA 条带可能的原因是RNase 处理时间不够，而如果是开环的DNA
或染色体DNA 断片则可能是震荡过激烈。
四，而对于染色体DNA 的条带亮度比较暗淡来说，我们组分离掉的染色体还很
成功。
五，点样处有亮带，说明有杂质蛋白质的存在 六，注意事项
一，酚具有腐蚀性，能损伤皮肤和衣物，使用时应小心。皮肤如不小心沾到酚，
应立即用碱性溶液、肥皂或大量清水冲洗。
二，注意上样时要小心操作，避免损坏凝胶或将样品槽底部的凝胶刺穿。也不要
快速挤出吸头内的样品，避免挤出的空气将样品冲出样品孔。
三，溴化乙锭是一种具扁平分子的核酸染料，可以插入到DNA 或RNA 分子的碱
基之间，并在300 nm 波长的紫外光照射下放射出荧光，所以可用来显现琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶中的核酸分子。溴化乙锭是一种强烈的诱变剂，有毒性，使用含有这种染料的溶液时，应戴手套进行操作。勿将溶液滴洒在台面或地面上，实验结束后用水彻底冲洗干净。
四，沉淀DNA 通常使用预冷无水乙醇，在低温条件下长时间放置可使DNA 沉淀
完全。除用乙醇沉淀DNA 外，还可使用0．6倍体积的异丙醇，但异丙醇也能将盐等杂质沉淀，所以沉淀需要在常温下进行，并且时间不宜太长(限20 min 内) 。沉淀离心后，需用70％乙醇洗涤，以除去盐类及挥发性较小的异丙醇。