第二部分 神经组织学方法
前言
神经组织学(国外统称作" 神经解剖学"neuroanatomy) 是对人体或动物体神经系统的微细结构进行观察, 研究神经组织细胞的形态与构造(包括显微结构和亚显微结构), 以及细胞间相互联系, 它们发生与发展的科学.
在过去几十年内, 神经解剖学曾被认为一门僵老学科, 但自从电子显微镜发明以后, 神经解剖学已逐渐改变了过去的面貌, 特别是二十世纪七十年代以来, 由于神经生理学和神经化学为神经解剖学提供了一些新方法新概念(如萤光组织化学技术, 利用轴突原理的双标记技术, 突触概念, 免疫酶标技术.....), 使这个古老的学科获得了新的生机, 尤其是神经生理学与神经解剖学更紧密地结合起来, 探索神经系统的结构与功能以及它们的相互关系, 已成为神经生物学研究中最活跃的领域之一.
神经解剖学研究的问题一般可分两大类, 相对应的就有一些专门的技术(即神经组织学方法). 一类是研究神经组织一般形态结构的，相对应的方法有:Golgi法,Nissel 法，还有萤光组织化学等, 另一类是研究神经系统中的联系的, 相对应的方法有:Nauta( 纤维退化) 法:利用轴突运输的HRP 法,HRP ───萤光双标记,HRP ─放射自显影双标记, HRP─免疫酶双标记等:利用能量代谢的2DG 法; 体外组织培养方法..... 等等, 近年来由于与电生理手段的结合, 同于电子计算机的引入对神经系统的描述开始进入新的阶段, 例如三维图象的显
示, 利用CT 技术直接观察活的实验动物和人的活体组织结构.
二、 神经组织的处理过程及应注意事项.
神经组织学的基本方法和其它组织学方法相同, 必须先把有待研究的组织制成很薄的切片标本, 经过染色处理形成可供观察的图象在显微镜下进行观察, 研究. 神经组织染色处理的一系列过程虽然有的和处理其它组织相似, 但也有其特殊性, 应引起相当的重视否则会得不到应有的结果.
(一), 固定与固定剂
中枢神经系统(脑, 脑干与脊髓) 的固定根据需要可采取两种形式─整体固定法, 切块固定法.
(1) 整体固定法
当需要作整脑切片时, 用整脑固定法. 固定脑的容器要宽大(园缸较好), 用线扎住脑的基底动脉, 使脑倒悬于固定容器内, 各面都不应与容器壁接触, 以免受压变形. 脊髓的固定最好放在长形容器内, 使脊髓伸直. 如果在开颅前先自左心室或颈内动脉将固定剂灌注, 再取脑浸于固定剂内, 可有助于固定组织均匀迅速, 这种整体固定脑(连同小脑及脑干) 常需两周, 成人脑可长达1-2个月之久, 才能使脑组织变硬及固定良好.
(2) 切块固定法
新鲜脑组织切取材时, 应稍切厚些, 以便以后切片时受当时刀切面的影响. 现在采用的大部分新技术都先经固定液心脏灌流然后开颅取脑后切块再固定一或二天即可进行切片处理. 固定剂的选择首先决定于所用的方法及固定剂配方. 最常用的是10%甲醛( 福尔马林) 液或10%甲醛生理盐水液, 其它固定剂可见各种方法的具体要求.
(二), 切片
三种切片法(石蜡切片法, 火棉胶切片法, 冰冻切片法) 在神经组织技术上都较常用. 例如对一些神经末稍装置和溃变纤维的银染法和现采用的大部分新技术多用冰冻切片法; 大片的脑组织染色或镀银(Nissel法或Golgi 法) 以及髓鞘染色等多用火棉胶切片(常规及快速色埋法); 一些神经末稍装置多习惯用石蜡切片.
脑组织用石蜡色埋时, 浸蜡时间应稍长, 否则石蜡不易浸透. 用火棉胶色埋的脑组织, 除Golgi 镀银法及类似法以外，一般都需经充分的脱水和浸胶时间，Golgi 法(包括COX 法等)
因只需火棉胶起暂时的支持作用, 而且长时间的洒精脱水可致银(汞) 沉淀分解, 所以只要求火棉胶略浸入组织, 能达到切片的目的即可( 一般这类切片都较厚, 组织内部末浸透火棉胶也能切完整), 不需长时间在酒精或火棉内浸泡. 冰冻切片一般不需要媒介物的支持色埋, 但如需较大切片或松软易碎组织也可经明胶色埋后再切(组织经水洗后, 入5%,10%或20%明胶,24小时/37℃, 然后装于组织托上, 再浸入10%甲醛液内硬化, 即可冰冻切片).
除石蜡切片外, 火棉胶切片, 冰冻切片都无须贴于载破片上之后再操作染色. 较方便的办法是用直径10厘米玻璃培养皿盛装切片, 用烧扁头的玻棒或新毛笔捞取, 用吸水纸沾去多余水份或洒精等.
三). 应注意事项
1. 神经组织取材时动作要轻柔, 一般不要切取大块, 用洒精脱水时每级洒精的差度也不要太大.
2. 神经切片不要切很薄(如薄于10u). 如切薄片, 常会将要观察的结构切丢或分割成不成形的碎段.
3. 任何玻璃器皿, 尤其用于银染法的, 都应经清洁液浸洗后再用. 所有用过的玻璃器皿则应在未干的情况下立即洗净并浸泡于清洁液内.
4. 配制溶液应用蒸馏水. 配制硝酸银溶液最好用双重蒸馏水; 在溶解硝酸银后其溶液应清彻透明, 出现任何轻度混浊都应弃去不用.
5. 避免使用含金属离子(如铁筒盛装的) 洒精, 包括用无水硫酸铜脱水的无水洒精.
6. 试剂、染料一般不必大量配制贮存留用, 配制成溶液后以有色瓶盛装.
7. 夹取作镀银处理的组织块时, 避免用金属镊子, 如用金属镊时, 应在镊顶端沾溶蜡后再用. 捞取切片时用玻璃棒或新毛笔.
8. 准备一个小暗箱, 作室温镀金、银用.
9. 某些镀银或染色等过程要求在高于室温的恒温箱内进行几天; 这种温箱的质量应注意选择, 绝不能使用那种控制温度不稳定的产品.
10. 多参阅别人的报导资料, 吸取经验. 自已在操作过程中也要随时记录工作情况(例如时间、温度、试剂浓度以至水洗次数等) 。所得结果最好能通过显微摄影（用彩色摄影更好）拍照留底。
实验一、 神经元形态结构的观察
神经细胞是构成神经系统整个结构的基本单元，也是一个最基本的机能单位。由于神经元是一个高度分化的细胞，所以它具有一个独特的外形：除了具有细胞体外，还有丛状的树突和细长的轴突。又由于不同部位的神经细胞执行其功能的不同，形状变化差异很大，因此神经细胞的分类法很多，大致有以下几种：
锥体细胞（分布于大脑皮质 Ⅲ ，Ｖ层：Ｖ层以大、中型锥体细胞为主）。
(1)按胞体形状分 星形细胞（分布于脑和脊髓灰质内的神经胶质细胞
棱形细胞（主要分布于皮质的深层，大脑皮质第Ⅳ层中最多）。 颗粒细胞（分布于大脑皮质Ｉ、Ⅳ层和小脑皮质Ⅲ层）
(2)按细胞突起分 假单极细胞(脊髓神经节细胞)
多极细胞(小脑蒲金野氏细胞, 脊髓运动神经元).
运动神经元(皮层锥体细胞, 脊髓中多极细胞).
(3)按功能分 感觉神经元(胞体较小, 主要分布皮层II, III层中).
联络神经元(脊髓的中间神经元).
⑷按化学能分 5—HT 能
5多巴能 脑干部位多
去甲肾上腺能
多肽能 内腓肽 脑的其他部位
脑腓肽
神经元的躯体直径通常
1、胞外膜(membrane)
约为5毫微米厚, 由二层类酯分子组成. 不同的神经元膜结合各种特殊的蛋白质, 具有泵、通道、受体、酶和结构蛋白质等多种功能。
２、 (cell body )胞体
神经细胞胞体与其它细胞(肌肉细胞, 腺体细胞.....) 的区别有以下三个特征:
(1) 空泡状核. 神经细胞体核通常球状、较大、染色质颗粒细而分散，外观呈空泡状。 （２）核仁大而显著. 因为神经细胞没有分裂能力, 而它的代谢又如此之旺盛( 每天要消耗1/3蛋白质), 势必形成核大.
(3) 核周质有好多细胞器:a、尼氏体.(又称粗面内质网, 可用Nissel 法显示), 胞体内特多, 轴突和树突中少, 轴丘中没有. 不同神经元尼氏体的大小, 形状都不一样, 可能与细胞代谢有关.b 、光面内质网. 常与粗面内质网连续, 并伸入树突和轴突内，它与粗面内质网的区别是上面没有核蛋白质体, 被认为是迅速传递物质的结构.c 、高尔基氏体。环绕胞核分布，并可伸入树突主干。d 、线粒体. 呈颗粒或细杆状, 缩时摄影拍摄培养神经元时看到它的形状大小不时在改变. 线粒体内酶系特别多, 是蛋白质合成和分化的工厂.e 、微管和微丝. 微管直径约20-26nm, 壁厚6nm; 微丝直径约10nm, 高倍镜下也呈管状, 壁厚3nm. 它是较细的神经肌动蛋白聚合体, 这些微管、微丝在轴浆中松驰地平行排列，一般认为与神经元的运输有关。
就功能而言，胞体对输入信号加以整合并发出信号，另外也可接受输入信号，如轴突─胞体突触，即轴突信号输入给一组新神经元的胞体；此外，胞体还司理整个神经细胞的营养。
３。轴突(axon)
又称纤维, 每个神经元都有一个轴突, 它是发生及传递兴奋的一个结构. 电子显微镜观察在轴突离开细胞体的地方形成一个园锥形的突起称" 始节"(或称轴丘), 该部位嗜色性较差, 既无尼氏体也突触连结. 当神经细胞发生兴奋时轴丘部位的细胞膜最先去极化, 因此轴丘被认为是神经冲动(即动作电位) 的发源地.
所有的轴突都被许旺氏细胞色裹起来, 在一些情况下 ,许旺氏细胞简单地以一薄层包裹轴突, 通常被称为" 无髓纤维", 如交感神经的节后纤维, 内脏神经的感觉纤维, 它的传导速度比较慢 .在许多情况下, 许旺氏细胞在胚胎发育过程中自已绕于轴突, 形成多层紧密的绝缘称" 髓鞘"( 它的结构成分是髓磷脂) 髓鞘沿轴突每隔大约1mm 被一个狭窄的间隙所中断, 这间隙称" 郎飞氏结" 有髓纤维的传导速度快.
轴突内是一种很均匀的液体, 称" 轴浆"(Axoplasm),它与胞体内原生质相连, 关于它的化学结构正被广泛地研究, 根据目前了解它是一种硬的凝胶, 内含大量的K+, 少量的Na+、氯化物和一些蛋白质。
轴突的功能是将胞体发出的传出信号输送到轴突末稍，通过轴突末稍把信息再传递给一组新的神经元。
４。树突(dendrites)
各种神经元由于其执行功能的不同，形态结构有很大差异，具有各种特殊形态的树突，如小脑蒲式细胞树突似扁柏枝。
根据树突走向的不同又可分为顶树突及底树突. 顶树突垂直于皮层表面, 其末端在接近皮层表面的部位时不断分支构成分子层或丛状层. 底树突则在胞体周围分支。树突的表面密密地披着一层侧棘, 每个侧棘有一根极细的柄, 直径在1微米以下, 柄的末端呈球状隆起, 在电子显微镜下观察轴突末端与侧棘尖端接触可构成轴突─树突突触.
就功能而言, 树突的功能是接受输入信号.
(一) 实验目的:
通过幻灯片、切片的观察充分认识神经元是一个高度分化, 具有独特外形的细胞. 要求掌握显微镜下观察到的神经细胞的基本构造, 并熟悉电子显微镜显示的神经细胞的微细结构及胞体内各种细胞器的形态.
(二) 实验用品:
显微镜, 双筒解剖镜, 幻灯机, 幻灯片, 切片标本.
(三) 实验内容:
1. 幻灯片观察
(1) 神经元的基本形态
A 神经元模式图
B 哺乳动物神经系统中发现的神经元类型。
C 光学显微镜中显示的各种神经细胞的形态.
(2) 电子显微镜中拍摄的神经元构造
D 成年老鼠大脑皮层, 显示一个小锥体神经元的细胞体(主要显示各种细胞器)
E 成年老鼠的脊髓切面，显示了一个前角细胞的尼氏体。
F 老鼠的耳蜗核切面，显示细胞核内的色涵物.
G 成年老鼠的大脑皮层，显示一个锥体神经元的顶树突。
H 老鼠的视皮层, 显示大脑皮层神经丛中的树突.(原生质中含微管, 微丝, 线粒
体, 光面内质网等细胞器; 许多树突棘的剖面被显示, 且可观察到棘与轴突末稍形 成的突触.)
I 老鼠脊髓的前角, 显示运动神经元始节纵切面.
J 成年老鼠的大脑皮层, 对比显示轴突始节和轴突终末.
K 来自组织培养的一个交感神经元的生长锥电子显微镜照片.
N 显微镜下切片观察
(1) 人体或动物的整脑连续切片
观察了解脑中各核团及纤维束的排列概况.
(2)Nissel染色法显示的大脑皮层质切片
了解大脑皮质各区神经细胞构筑, 对照图谱观察区分大脑皮质六层细胞及排列特点.
(3) Golgi法浸染的大脑眼质切片
观察掌握大脑皮层中各类神经元的基本形态.
(4) Nissel法显示的小脑皮质切片(横切)
掌握小脑皮质的细胞构筑分为三层分子层, 蒲金野氏细胞层及颗粒层. 区分三层细胞的排列特点.
(5) Golgi法浸染的小脑皮质切片(横切)
观察掌握小脑皮质中各类神经元的形态, 特别注意蒲金野氏细胞的形态特征.
实验二、神经组的染色技术
组织通过固定、脱水、色埋、切片等一系统过程之后，制成菲薄的组织切片，这种切片如不经过任何色彩的浸染，只能根据组织内部各种物质的折射指数不同，从光线的明暗上使我们看到一些组织结构，但远不能满足观察的要求，因此一定要通过染色这步骤。
染料是一类有色的有机化合物，不但要有鲜艳的色彩，而且对于纤维或组织必须具有亲和力，能将各种组织成分染成不同的颜色。染色过程不外乎化学反应和物理现象或两者结合过程，但染色料与组织究竟怎样结合，有些现象目前仍不能作出合理解释，尚需进一步探讨。 １、化学反应
主张染色过程是化学反应者认为，其化学反应的基本原理是：根据细胞内不同化学成分对染料有不同的亲和力，因此细胞具有选择性的着色能力，使细胞的不同成分染成不同的染色。例如，细胞内的酸性物质（如核酸）易被碱性染料所染，因为它对碱性染料的亲和力很强。细胞内的碱性物质（如细胞质）易被酸性染料所染，因这它对酸性染料的亲和力很强。因此，当细胞在酸性染料中染色时是有染色能力的阴离子与细胞内的碱性物质相结合，即细胞质（碱性）能被酸性染料着色。反之细胞在碱性染材中浸染时，细胞内的酸性物质与碱性染料中有染色能力的阳离子相结合，所以细胞核（酸性）能被碱性染料着色。
此外，染液的ＰＨ值对染色在很大关系，一般碱性物质在ＰＨ值较低（酸性）染液内着色；酸性物质在ＰＨ值较高（偏碱）的染液内着色。
２、物理现象
主张物理学说者认为染色过程中无化学反应，而是物理的吸附作用，毛隙现象，吸附作用或称作用或称溶液作用。当组织浸于染液内，由于染液中分散的色素粒子的分子引力作用，使色素粒子被组织吸附而呈现颜色。另外，如用苏丹III 染脂肪组织，由于苏丹溶于脂肪之中（在水中不溶），因此它是一种溶解现象。
３、媒染剂、促染剂及分化剂
（１）媒染剂：是促进染色能力的，它与染料或组织相结合，使染料与组织发生染色现象。媒染剂多用于天然染料，如苏木精和卡红。
（２）促染剂：它与媒染剂不同，不参与染色反应，只是增强染色能力，如在美兰中加适当量的氢氧化钠，或在伊红内加少量冻醋酸，则可增强染色能力。
（３）分化剂：也称脱色剂，分色剂，鉴别剂。分化剂是用来脱掉组织或切片过染的染料而使用的试剂，使受染的组织染色适当，色彩清晰。一般地说，分化碱性染料可用稀的酸性溶液；分化酸性染料则用稀的碱性溶液，分化剂大致有以下几种：
a. 酸性分化剂, 一般多用冰醋酸或盐酸, 其浓度一般为0.1-1%的水溶液或70%洒精溶液. 组织在酸性溶液中吸附氢离子而带正电荷, 从而使带正电荷的碱性染料脱掉.
b. 媒染分化剂, 铁苏木精染色法中使用的铁钒即为媒染分化剂, 它在染色前起媒染 作用, 而染色后可用它脱色.
c. 氧化分化剂. 氧化分剂是一种弱漂白剂, 例如赤血盐及苦味酸, 能将切片所有染色无选择的脱掉, 但由于不同组织对染料的亲和力不同, 这样实际上将结合不牢的染料脱掉而保留一部分颜色. 如Weigert 髓鞘染色法中用赤血盐分色.
(一) 实验目的:
通过实验操作使同学掌握神经组织最主要的几种染色方法, 另外通过染色后显微镜检查, 进一步熟悉大脑, 小脑中各类神经元的形态.
(二) 原理:
Golgi染色是利用硝酸银和重铬酸钾化合的原理, 可在神经细胞质内产生极微细的沉淀, 从而把整个神经元形态显示出来. 它的特点是仅显示部分细胞及其突起, 所显示的部分细胞散在各处不同部位, 因此联系神经细胞各结构之间的关系比较易于观察. 本法的缺点是不易
掌握, 重复性不够理想.
Nissel法染色原理:尼氏体又名" 虎斑" 本系神经细胞体内含有的特异性嗜色质, 利用碱性染料(如甲苯胺兰, 焦油紫, 硫硅等可染出尼氏体. 它在各种神经细胞内形态不尽相同, 所以一般已习惯于借尼氏体来辨认或鉴定神经细胞的存在, 它们的分布以及是否发生病理性的改变. 尼氏法染色手续简单, 不会失败; 唯一缺点是易于退色, 其原因在于染料的不牢固性, 故切片在分色. 脱水占应充分用二甲苯洗去分色液及脱水液, 封片采用中性合成树脂并避免光保存, 这样可免于过早退色.
髓鞘染色法原理:髓鞘是一种磷脂, 它可使锇酸还原成金属锇而现黑色, 但锇酸使用有很多不便, 例如价格昂贵, 浸透性差等. 因此采用劳克坚牢兰(Luxol Fast Blue)染色法能较简便的 染髓鞘为鲜兰色.
(三) 实验用品:
切片机, 染色缸, 各种手术器械, 定时钟, 大白鼠脑
(四) 实验方法:
1. Nissel法染尼氏体(虎斑")
(1)给组织固定:杀死动物后快速开颅取脑( 切取2- ５毫米厚的组织块) , 固定于Carnoy 液; 或中性甲醛液(或甲醛生理盐水溶液);80%洒精;
(2)切片:将固定的组织块经脱水后用石蜡色埋(也可用火棉胶色埋), 石蜡切片8-10微米厚; 火棉胶切片可切成15-20微米.
(3)切片下行至水:(石蜡切片)
二甲苯 1-2分钟
1/2(纯洒精+二甲苯 1分钟
95%洒精 1分钟
80%洒精 1分钟
70%洒精 1分钟
蒸馏水洗 片刻
(4)在下液中染色20-30分钟(如60C 温度箱染色则约3-10分钟), 然后蒸馏水洗. 焦油紫 0.1克
蒸馏水 99毫升
1%冰醋酸水溶液 1毫升
(5)用95%洒精分色. 分色时应注意控制, 既不使分色不足, 也不使其过度; 一般稍分色不足则对以后操作有缓冲作用.
(6)经无水洒精数次, 二甲苯内充分洗涤使尽重洗除洒精.
(7)中性树脂封片, 盖片.
(8)显微镜检查.
结果:尼氏体呈紫色
细胞核呈淡紫色
注:①焦油坚牢紫Cresyl Fast Vilet及硫硅均可代焦油紫. 硫硅更适于洒精固定的组织. ②切片分色也可在0.1%伊红,95%洒精溶液内进行, 结果纤维等被染成淡红色.
③对火棉胶切片, 可将染液再按1:10用1%醋酸水溶液稀释, 染色过夜, 然后水洗, 分色. 2 灌注的快速Golgi 法
(1)从动物左心室灌注0.5%亚硝酸钠的生理盐水溶液, 灌注时应打开静脉( 或右心房剪一小口) 放血. 亚硝酸钠的作用是便小血管扩张, 易于使固定剂达到各血管末稍部位. 灌注至血色消失即止.
(2)大量10%甲醛生理盐水继续灌注, 至静脉流出液无色且可嗅出甲醛气味.
(3)继续用下液灌注, 此液主要起媒染作用, 便细胞易于与银亲和.
水合氯醛 50克
重铬酸钾 50克
溶解后加浓甲醛液 100毫升
最后加水至 1立升
(4)将脑剥离颅腔, 切取2-5毫米厚的组织块, 再静置于上液内放暗处3天(不必摇动).
(5)换入1%硝酸银水溶液, 暗处3天.
(6)急速火棉胶色埋切片(或冰冻切片), 厚100-150微米, 切片浸于2%重铬酸钾内.
(7)急速水洗, 吸水纸沾净,100%洒精脱水, 经冬绿油(或木馏油─甲苯─石碳酸) 透明.
（8）经甲苯冲洗数次后即可用合成树脂封片或加盖玻片（最好不加）
(9)显微镜检查.
结果:神经细胞胞体、轴突、树突（可见到树突上的棘及小芽结构）都呈黑色，背底为淡黄色。神经胶质细胞（以星状胶质细胞出现率最高）。毛细血管周细胞等都能显示。 此方法对成年组织无选择性，效果较可靠。
３、Holmes 法染神经原纤维.
此方法也是利用神经组织对银的反应, 然后还原或" 显影",
(1)组织经10%甲醛固定或灌注.
(2) 流水冲洗12小时或更长, 脱水后石蜡色埋切片.
(3)切片烘干后脱蜡" 下行" 至水(具体操作同前).
(4)在20%硝酸银液内1小时(室温, 暗处).
(5)换三次蒸馏水, 共10分钟(或冲洗).
(6)在下液内镀银12-24小时(37C).对每一切片的银液量要不少于20毫升.
先配Holmes 硼酸──硼砂缓冲液.
A. 硼酸 12.368克(M/5)
蒸馏水 1000毫升
B. 硼砂 19.071克(M/5)
蒸馏水 1000毫升
取A 液55毫升+B液45毫升,PH=8.4,用蒸馏水稀释至494毫升. 加入1%硝酸银1毫升, 再加10%吡啶水溶液5毫升. 摇荡混合, 新鲜使用.
(7)取出切片甩去多余银液, 浸入还原液2-3分仲. 还原液配制如下:
对苯二酚 1克
无水亚硫酸钠 5克
蒸馏水加至 100毫升
(8)流水冲洗3分钟, 再换蒸水洗一次.
(9)0.2氯化金液调色3分钟, 水洗.
(10)入2%草酸水溶液3-10分仲, 至神经细胞逐渐由红变成深红, 最后呈黑色. 水洗, 并固定于5%硫代硫酸钠液5分钟, 充分水洗.
(11)脱水, 透明, 封片.
(12)显微镜检查.
结果:神经细胞及纤维均为黑色.
注:①在2%草酸液内调色至暗红色较好.
②切片如在水洗后脱水至95%洒精时, 也可用劳克坚牢兰(Luxol Fast Blue)复染髓鞘. 劳克坚牢兰 0.1克95%洒精溶液
染1小时,(37℃)
95%酒精洗，入蒸馏水。
0.5-1%碳酸锂分色, 再在70%洒精内继续分色至灰质与白质分清.
水洗, 脱水, 透明, 封片.
结果:细胞呈暗红色:纤维黑色; 髓鞘兰色.
4. 劳克坚牢兰─焦油紫同时染髓鞘及尼氏体法.
此方法较简便, 同时能染尼氏体, 很适合教学用.
(1)组织经10%甲醛固定, 石蜡切片" 下行" 至水.
(2)在劳克坚牢兰液内染色1-3小时, 室温或55-60温箱内进行(可延长至12小时). 劳克坚牢兰 0.1克
95%洒精 100毫升
10%冰醋酸 0.5毫升
混合后过滤使用.
(3)水洗后在0.05%硫酸锂水溶液内分色约1分钟, 再以70%洒精最后分色至背景无色.
(4)水洗后, 经焦油紫液染尼氏体, 室温15分钟.
0.1%焦油紫水溶液 40毫升
10%冰醋酸水溶液 0.4毫升
(5)水洗,95%洒精分色. 或用下液分色.
95%洒精 90毫升
氯仿 10毫升
冰醋酸 3滴
（6）95%酒精洗两次，经无水酒精脱水，及二甲苯透明，树脂封片。
(7)显微镜检查.
结果:有髓纤维呈鲜兰色, 神经细胞的内尼氏体为紫色, 对比明显.
注:①如用1%中性红水溶液染尼氏体, 染色5分钟亦可.
②如改为冰冻切片则稍染焦油紫(约5-7分钟). 用水洗, 再按下法染油红0, 则溃变的有髓纤维可呈红色.
油红0 0.5克
异丙醇 100毫升
同时将上面储备液6分加蒸馏水4份，混合后略停约5分钟, 过滤. 染油红o 10-15分钟,70%洒精分色. 水洗, 甘油明胶封片.
结果:末变性有髓纤维兰色, 溃变有髓维纤红色, 尼氏体紫色, 核兰紫色.
*注:①染色结束后一定要在显微镜下他细观察, 检查自已染色是否达到要求, 同时通过显微镜观察, 进一步熟悉大脑, 小脑各类神经元的形态.
②, 由于学时数有限, 本科生可选择二种方法染色, 研究生四种方法最好操作.
实验三 中枢定位标记实验
（一）目的与原理
在使用电生理方法研究脑内某个核团细胞的胜利特性之后，为了验证所记录的电特性确实来自该核团细胞则需要找到电极尖端的所在，且对照图谱标定它的确切位置。本实验的目的即是用微电泳的方法把某种染料（如固绿Fast Green ）注入到脑内预定的部位，然后通过组织处理，切片，显微镜检查找到标记电极尖端的位置。
通过实验操作要求掌握微电极定位技术和微电泳技术，了解中枢定位标记的意义。
（二）设备和实验动物
设备：手术器械，定位仪，电泳仪，冰冻切片机 ，麻醉剂，固绿等试剂
实验动物：大白鼠（体重最好在200克以上）
（三）实验步骤
1． 动物麻醉。用乌拉坦（20%）水溶液）静脉注射，按动物体重计算通常用量为
0.5ml/100g，实际用量视动物状态而酌情处理，观察动物处于深睡状态，呼吸均匀，四肢松弛即可。
2． 打开脑颅，剥去硬脑膜（注意不让流血），然后把动物固定于立体定位仪上，校正
好微电极尖端三维零点。
3． 取刚拉制尖端约50μ的玻璃微电极（管内有纤维丝），灌入固绿溶液。
固绿 1克
蒸馏水 20毫升
充分溶解（可加热溶解）后过滤备用。
4 接好电极，参照图谱选取某核团，按图谱标出的三维空间数值将微电极插入恼内且
记录下电极尖端的位置。
5 电极末端接阳极，参考电极接皮肤切口处。通电15分钟，通电过程中一定要注意
检测电流强度，使电流强度维持在几个微安（通电开始时电流强度可以达到几十微安 ，很快下降，且可保持在几个微安值）
6 移动一下电极位置，重复上面过程再电泳一个点。
7 打开胸腔，心脏灌流。
A 先取生理盐水（内加3.8%柠檬酸钠以抗血液凝固）200—250毫升，在左心室剪一小口，从左心室插入主动脉，灌入溶液且在右心房剪一口让血液流出，待流出液无血色即停止灌流。
B 取10%福尔马林生理盐水继续灌流，到流出液中可嗅出甲醛气味，脑表面已变色即停止（约需200—250毫升）。
8 将脑剥离颅腔，剪去硬脑膜，然后放入盛有10%福尔马林液的容器内再固定20小时
左右（容器不能太小，溶液体积应是脑体积的10—20倍）。
9 连续冰冻切片（每片厚40-50微米），将切片贴于载玻片上，烘干，显微镜下检查
有否绿色标记点。
10 对照图谱观察标记点位置是否与所需标记的核团位置相吻和。
若注入HRP ，则切片后经染色可观察标记细胞的形态，以及它与其他神经元的联系。
实验四、钴盐法确微电极尖端位置
(一). 目的与原理
在使用微电极研究脑内单位(unit)的生理特性之后, 一个重要的问题是这个单位究竟属于那个核团, 在核团的什么位置? 回答了这个问题, 工作才更有说服力, 更有价值. 通过微电泳的方法把钴盐注射到脑内, 然后通过组织化学的方法就可找到电极尖端的确切位置, 这即是所研究单位的位置.
(二). 设备与标本
设备:(1)视野计和马达驱动的剌激图型.
(2)通用电生理记录系统.
(3)双目解剖显微镜.
(4)电泳仪.
(5)常规组织化学仪器:切片机, 染色缸等.
(6)玻璃绝缘的W 丝微电极.
(7)CoCl2,(NH4)2 S,甲苯酚紫试剂.
标本:青蛙视顶盖(在位).
(三). 实验步骤:
1. 在蛙视顶盖记录一个神经节(G)细胞末稍的放电或一个顶盖细胞的电活动.
2. 用微电泳方法注射Cocl2:电极尖端2-4u, 灌注2.5M Nacl 和50M Cocl2通过以正脉冲电流, 强度1-1.5uA, 波宽0.5秒, 频率1HZ, 电泳时间为20-30分钟.
3. 立即取出脑, 剥去硬脑膜, 浸入( NH4) 2S 液( 在10ml 任氏液中加0. 05- 0.1ml纯(NH4)2S)，45分钟后取出用任氏液冲洗, 然后固定于10%福尔马林中.
4. 经各级酒精脱水→石蜡色埋→切片(切片厚15u).
5. 将切片粘贴于载玻片上, 烘干, 且用甲苯酚紫复染.
6. 显微镜下观察, 仔细寻找在顶盖中很多兰紫色细胞核中一个黑色斑点(斑点直径约15-50u), 这就是电极尖端位置.
(四). 参考文献
1. Picman et al ,(1972)Seince 176,412-414.
2. 王书荣等(1981).
实验五、辣根过氧化酶ＨＲＰ微量注射与离子透入法。
I. HRP技术的简单介绍.
70年代初一种新的技术引入到神经解剖学, 这使人们对脊椎动物的脑的了解, 特别是关于各核团间的联系的知识有了几乎是瀑炸性的增加, 这就是辣根过氧化物酶(HRP)技术. 今天世界上不用这种技术的神经解剖与神经生理学实验室已经不多了.
HRP(Horseradish Peroxidase)辣根过氧化物酶是一种大分子的蛋白质, 分子量约40000道尔顿, 分子半径是3.0nm, 可用它作为示踪物. 自从它被( Kristensson et al 1971:Lavail and Lavail,1972) 引入以来已证明了:在中枢或外周神经系统中, 为了明确地识别或鉴定一个神经细胞体纤维突起的起源, 或为了清晰地展现整个细胞体(包括它的轴突和树突) 的形态是一个既可靠又灵敏的方法.
这个技术的基础是神经元内的物质运输, 俗称" 轴突运输" 这种运输可在两个方向上进行:正向运输(即从胞体──纤维末稍) 逆向运输(即从纤维末稍──胞体). 又由于HRP 可使联苯胺的衍生物与双氧水发生呈色反应(即氧化反应), 因此把含有HRP 的切片放在具有显色基团的溶液中, 则HRP 会呈色因而把神经元的形态清晰完整地呈现在我们眼前.
(一) HRP方法的三种基本应用;
(1) 突触输入源的识别
将HRP 注入轴突末稍区域, 由于这递送示踪物的吸收和逆向运输可以显示提供突触输入到注射区域的神经元胞体, 这种高灵敏度的组织化学方法的使用经常可以展现一个被标记神经元的全长度, 包括它的树突树, 轴突和轴突侧支. 另外,HRP 的递送还可能与另一种独立注入的第二标记物( 例如放射性标记物或萤光化合物有益地结合, 通过逆行双标记确定侧支投射的存在.
(2) 传出神经突起的确定
注入进灰质的HRP 可以导致示踪物被神经元胞体大量的吸收, 这些神经元在大量摄取后将通过轴突运输示物到它的突触末稍, 由于HRP 的呈色即能将神经元的传出通路呈现在我们面前.
(3) 类似Golgi 的神经元染色.
注入进灰质的HRP 可以在几分钟-几小时内导致实心地填充, 象Golgi 法一样浸渍神经细胞体, 树突和它们的部分轴突分支. 也可以将HRP 直接供给灰质, 神经束和外周神经中被切割的轴突, 通过顺向或递向运输导致细胞体和轴突稠密地填充, 因而展现整个神经细胞的形态.
(二) HRP的结合和运输
A. HRP的特性
辣根过氧化物酶HRP 是一种含有正铁血红素基团的糖蛋白, 这种正铁血红素基团对于它的组织化学活性是基本的. 当它的基质(过氧化氢H2O2) 存在时,HRP 能催化一些化合物(联苯胺的衍生物) 的氧化作用 ,因此产生一种可见的反应产物.
大多数商业来源的HRP 含有几种与酶或同功酶近似相关的混合物, 因此HRP 最好事先纯化, 使其较稳定, 可以先配制好保存在5℃以下数天也不会变质.
B. HRP的扩散
HRP分子是足够小的, 当用心室内注射的方法引入无损伤的脑中时, 它通过细胞外空间以大约0.5mm/小时的最小速率扩散. 直接HRP 注入进脑中导致的酶扩散, 能从酶的释放位置扩散几个毫米到几个厘米, 扩散变化的程度取决于注入的量, 注入的速度，机械损伤的程度和发生脑水肿的程度. 通常注入后几小时内明显地扩散, 大约18- 24小时后扩散开始缩减,5-7天之后消失, 据1979年phillipson 报导, 随着离子电泳的释放,HRP 扩散斑点在4小时内达到最大尺寸, 而24小时后这个直径将收缩到约1/3.
C HRP的渗入
(1) 通过末稍HRP 的吸收
当注入的HRP 被无损伤地递送时, 示踪物主要通过突触末稍( 包括感觉神经节细胞的外周端) 摄取. 电镜研究显示了, 在注入后的不同时间内,HRP 依次出现在胞饮泡, 膜状囊和膜状管中以及多泡中和致密体(即溶酶体) 中. 随着注射后较长时间间隔HRP 又以相同的顺序从这些成分中消失.
通过末稍的HRP 的吸收是直接和它们的突触活动相联系的, 例如用控制突触活动的方法则HRP 的吸收会明显地减少, 抑制的方法有：用系统的戌巴比妥(pentobarbital),或将来自神经元输入的兴奋性迁移; 另外还可以通过剌激使吸收增加. 一般, 生长期的细胞HRP 最容易被摄取.
(2) 通过轴突HRP 的吸收
用电镜研究取得的一个十分出色的成果是:HRP能被轴突(特别是有髓轴突) 胞饮. 用光学显微镜的研究指示:示踪物可以瞬时的进入外伤的轴突（如注入场所的轴突），然后向近侧和远侧移动. 显著地, 被摄取的HRP 通过这些被损伤的轴突向外扩散, 因此在注入24 小时后示踪物很少再能在它们的母细胞体或它们末稍分板中被观察到. 被遭到压榨或切割而严重受损伤的轴突能大量地摄取HRP, 轴突邻近残肢中的大量示踪物最终被运输到核周体而给溶酶体降解掉; 远侧残枝中的HRP 则被运输到突触端, 并当这轴突不可避免地遭受华勒氏变性(断离神经纤维的脂肪变性) 时,HRP 最终被吞噬。
被损伤轴突的顺向和逆向示踪物填充能确立神经束的起端, 末端和端外周神经. 然而, 在严格地轴突通道中运输的HRP 能导致神经元核周体和轴突稍的标记.
(3)逆向轴突运输
HRP的逆向运输似乎依赖于微管的完整, 因为当使用秋水仙素和长春花这类微管阻滞剂时, 能阻断HRP 向核周体方向的递送.
被HRP 标记的微管, 液囊, 囊泡运到胞体后通常累积在具有Golgi 复合物的核周区域内, 然后随着互相扩散而形成较大的结构, 通常被认为液泡, 多泡体和致密体(即溶酶体), 整个胞体(包括树突) 最后可以充满载有HRP 的溶酶体. 大约3 天后随着酶降解，溶酶体中的HRP 量显著地减少:4-8天之间大多数溶酶体排空HRP.
用比较不灵敏的DAB 方法是温血动物轴突中测得逆向运输速率约70-120mm/day范围内:而在冷血动物中, 它的运输速率是相当慢的.
(4) 通过细胞体的吸收和顺向轴突运输.
HRP通过神经元胞体的直接吸收几乎只发生在注入场所或附近高浓度的区域. 被胞体的吸收的HRP 即被递送到溶酶体, 在那里它被逐渐地降解. 当发生HRP 整块大量的流入时, 那末就将随之发生明显的顺向运输, 而且可以被检测到.
科学家们普遍认为HRP 的顺向运输是和快速轴浆流动有关, 例如Mesulam and Mufson(1980)使用灵敏的TMB 方法在老鼠神经节细胞轴突中测得HRP 顺向运输的速率至少每天300mm.
(三). 方法学
A. 麻醉剂的选择
系统麻醉剂对HRP 的吸收与轴突运输的影响仅仅刚开始在探索, 然而初步的研究证明了在足够剂量水平时,HRP 的吸收与运输现象都能被戌巴比妥抑制。例如Rogers et al在老鼠体内实验发现:当把HRP 供给运动物迷走神经之后, 对动物施以50mg/kg的戌巴比当(相当高的剂量), 结果能减小逆向细胞标记和顺向轴突标记.(同使用乌拉坦相比较, 乌拉坦的用量为
1.5g/kg)
B注入酶的方法
最通常使用压力注入法或电泳法注入酶.
(1) 压力注入法
当使用这种方法时,HRP 通常被溶解在蒸馏水, 无菌盐水, 或磷酸缓冲盐水中( 4-50%的浓度). 扩散范围被注入的HRP 溶液的浓度和容量而增加, 大多数人使用0. 05-0.5ul(微升) 的容量. 据报导一个使用DAB 染色方法的资料中, 为了获得具有0.2- 0.5mm直径的扩散斑, 容量必须相当小约0.002-0.01ul(微升).
扩散斑的大小不仅和注入液的浓度和体积有关, 还和注入场所的组织特性有关, 例如一个给定的量普遍地在皮层下灰质比皮层组织产生的扩散区域大. 另外, 很明显地扩散斑的大小还随着使用的组织化学方法的不同而变化.
(2). 电泳注入法
为了达到较小的注入范围, 为了避免由于HRP 溶液的注入容量而引起组织损伤,Graybiel and Devor(1974)创立了一种递送HRP 的电泳方法. 大多数研究者用的电泳法的频率范围是5-0.07HZ; 电流范围是1-10uA
当电流低于1uA 时则不发生传递, 注入时间有小于5分钟, 或大于30分钟的;HRP 的浓度通常有10-50%
HRP电泳的设备是恒流源, 图A 即是一个具体的线路, 这种恒流源要有监视电流的功能, 因为注射过程中常常会发生电极尖端阻塞的现象.
注射用的电极一般要经过打尖处理, 尖端直径可1-100u 作细胞内注射的电极尖端要小约1-2u, 且必须进行研磨加工. 因为电极与HRP 注射关系较大, 所经一般要作准备性实验, 装置如图B 所示:Saline可用生理盐水或生理盐水──琼脂液, 注射电极接电源正极. 据报导为避免阻塞, 有人使用正泳冲电流(Gilbert and wiesel 1979). 通过这种准备性试验可以摸索一些实验条件, 还可选合适的电极.
(3) 轴突创伤后的标记法
在暴露的切割神经纤维端上用HRP 干粉或HRP 溶液都能达到标记. 这种方法产生顺向和逆向运输使HRP 注满轴突和胞体, 因此常被用来标记中枢神经束和外周神经纤维的起源和终止. C存活时间
最佳存活时间取决于轴突运送HRP 的速度, 所研究的纤维系统的长度, 以及一旦示踪物到
达细胞体后它的溶酶体的降解速度. 例如用DAB 已估计出HRP 逆输速度在50-120mm/day范围内, 但由于DAB 方法相当不灵敏所以实际的运输速率还要快一此. 其次, 注入区域中的神经末稍分支的密度和运送HRP 的速率也有关(运送HRP 的速度与纤维直径有关). 再其次, 系统的功能状态也决定着轴突末稍吸收HRP 的速率, 用电或其它剌激的方法可以加速HRP 的渗入和运送. 最大的细胞标记所需要的时间不仅只取决于HRP 的积累速度, 还取决于它被溶酶体(无活) 的变化速率. 因此, 要精确地给出某一纤维系统的最佳存时间是困难的. 需要通过实际试验. 目前大多数研究者在哺乳动物中常采用24-48小时的存活时间间隔; 冷血动物需的存活时间比较长, 约几天; 年青不成熟的动物由于在生长发育期轴突尖端有显著的胞饮活动, 所以最佳存活时间可稍微缩短.
D. 固定和切片
(1)固定
固定无疑是HRP 组织化学处理中最关键性的步骤之一, 为了达到提供最大的酶活性状态和减小扩散, 吸收与内生HRP 活性的二个参数必须予以特别的注意: 固定液的选择和固定的时间.
大多数的固定液都含有不同量的多聚甲醛和戊二醛, 但是也有许多研究者单独使用甲醛, 还有人用双倍醛.Courrille and Saint-Cyt(1978) 提出方法可执行外部预固定(即将动物先用6%葡聚糖灌流, 之后立即将脑取下浸在含氟里昂的烧杯, 再用液氮快速冰冻组织, 然后在一个低温控器上切片.
目前大多数研究者们采用的固定程序如下:先用一种含不同量蔗糖, 葡萄糖，葡聚糖的等渗NaCl 缓冲液灌流以冲去组织中的血液, 因为血细胞有内生的过氧化酶活性, 可以产生人工产物, 因此固定前先冲去血液是重要的. 接着用固定液灌流(通常灌15-30分钟). 然后 ,脑子被立即取出放入一个冷的(4℃)30%磷酸缓冲蔗糖液中后固定几小时, 为了保证内生过氧化物酶的失活. 或者还可以接着后固定将脑子放在保持4℃的蔗糖液中, 直到脑子沉到并底, 采用这蔗糖处理有三个目的:①排除过剩的固定液. ②用作一个低温防腐剂. ③降低以后染色中产生晶状人工产物.
(2) 切片
一般直接将组织放在低温控制器上切片, 但必要时组织也可用明胶或白旦白明胶色裹之后在冷冻切片机或低温控制器上切片. 由于不同色原的穿透力不同, 切片的厚度应随之变化, 例如BDHC 染色方法似乎穿透组织力较弱, 因此切片厚度不超过30-35微米, 而TMB 染色方法可切成50微米厚.
(四)HRP 的染色方法
为了产生HRP 组织化学反应, 切片组织被放在含有过氧化氢(双氧水) 和色原(通常是联苯胺衍生物) 的介质中孵育, 通过这过氧化物──过氧化物酶系统, 得到一种带色的产物. 最常使用的四种色原是: a. DAB( 3, 3` ─diaminocobezidine tetrahydrochloride) b. BDHC(benzidine dihydrochloride) C. TMB(3,3',5,5`te- tramethylbenzidine) d. O ─dianisine( 3, 3'dimethoxybenzidine
dihydrochloride)
A,DAB方法
DAB方法是证明神经元逆向轴突运输最通常使用的色原, 这方法的流行主要有以下几个因素:①DAB 方法技术简单. ②获得的结果容易被再复制. ③这方法产生的棕反应产物是嗜锇的, 因此DAB 染色材料可同时用作电镜研究④DAB 反应产物也是高度折射的, 因此可在暗视野光学显微镜下观察. ⑤当使用弥散注入时,DAB 产物通常能给出较清晰的神经元形态.
不足之处是这种棕反应物在产物在明视野显微镜中不容易看见, 而且在光学显微镜水平上DAB 方法的灵敏度不如BDHC 方法或TMB 方法.
B. O─Dianisidine 方法
Colman et al(1976)使用O-dianisidine(PH4.5),产生一种绿色的反应产物. 这种绿反应物在明视野光学显微镜中容易被观察, 此外在操作过程中发现使用o- dianisidine介质可同时充当低温防腐剂, 酶作用允许在0C 以下进行，因此酶的作用显然更好控制，然而可惜的是这绿反应产物很易退色.
C. BDHC方法
1974年Lynxh et al 介绍了一种用BDHC 作色原的束示踪方法, 用BDHC 作色产生物是兰色的, 在明视野显微镜中可见, 而且不象o-dianisidine 反应产物那样易退色. 但必须注意用BDHC 作色原由于使用的BDHC ─过氧化介质的PH 值不同可获得不同的颜色的反应产物; 而在酸性介质中易获得棕色反应产物, 而且二者的差别在暗视野显微镜中更为明显, 在酸性介质中获得的反应产物呈现微红色的银颗粒.
BDHC色原类似DAB 和似dianisidine 也是一种可疑的致癌剂, 因此处理这些基质时必须十分谨慎小心.
D.TMB方法1974年Holland et al 提出用TMB 作联苯胺代用品, 原因是①它明显的不致癌特性. ②认为TMB 比联苯胺更灵敏.TMB 反应产物在光学显微镜中很容易被观察, 在明视野显微镜中它呈现稍带点灰色的兰颗粒, 在暗视野显微镜中它呈现金黄色的颗粒.
尽管TMB 是一种有效的色原, 但很快研究者们发现TMB 存在以下的缺点:①TMB 反应产物易产生过度的结晶. ②反应时间不稳定. ③它不象DAB 反应产物那样亲锇, 而且TMB 反应产物对作电镜研究制备的组织本质上是高度可溶的有机溶剂. 由于存在这些不足, 因此TMB 方法对神经系统的实际应用被限制.
总的来说, 使用HRP 方法有以下优点:(1) 操作方法简单, 实验周期短(只需几天).(2)用此方法制成的标本可以同时作光学显微镜和电镜的研究( 在一个标本作连续超薄切片时隔一段取几张普通切片, 以作光镜对照观察).(3)对于生理学家来说, 这个方法的最大价值在于:它可以和微电极技术相结合, 和电生理观察密切地结合起来, 例如先对某一细胞的生理特性进行观察(观察细胞的电位变化, 研究细胞的电特性), 然后立即注入HRP 显示这细胞的形态结构, 或通过复染再显示这个细胞与周围细胞之间的关系. 所以HRP 技术是一种将生理和形态结合起来进行研究的比较好的方法.
尽管HRP 技术的引进还只有相当短的时间, 但此方法已成为神经科学研究中很好的特征工具. 近年来又出现了方法学的新阶段. 即为了某种特殊的需要采用二, 二特种技术相结合的" 双标记技术" 例如①使用Golgi 法与Nauta 纤维退化技术二者结合分析, 可用来研究神经元之间的联系. ②同时使用HRP 和萤光色素进行逆行标记, 可研究神经元的轴突投射. ③使用萤光色素和免疫组织化学相结合的免疫萤光技术, 可用来分析神经递质的分布. ④使用HRP 技术和放射自显影术相结合, 用[ 3H] 标记的[3H]─HRP 注入视皮层17区, 末标记的HRP 注入视皮层18区, 然后进行HRP 组织化学处理和自显影处理, 结果从HRP 反应产物和银颗粒标记中证明了在视皮层17,18 区存在的是外膝体细胞的侧技投射. ⑤使用体外组织培养技术和HRP 技术相结合, 可以在人工控制的条件下观察神经元的生长, 迁移过程, 吞饮HRP 过程, 以及视经元的退化过程等.
实验
(一) 目的原理
注入进脑灰质中的HRP 可被皮层中神经细胞体大量的吸收, 并通过轴突运输将HRP 运送到树突和轴突中, 经组织化学处理可展现神经元的形态.
通过实验操作初步掌握轴突运输原理在神经生物学中的应用, 在实验观察中要求和Golgi 染色法作比较, 用还HRP 技术显示的神经元形态的精确程度可以和Golgi 染色法相比较，优点在于它可以和微电极技术相结合, 了解神经细胞的功能与结构的关系.
(二) 设备
微量注射器, 微电泳, 立体定位仪, 解剖器械, 冰冻切片机.
HRP.3,'3G一二氨基苯胺(DAB),Tris液H2O2, 多聚甲醛等.
(三) 方法
A 辣根过氯化酶HRP 微量注射法.
1. 麻醉, 动物(大白鼠) 用10%乌拉坦(剂量为1克/10毫升/公斤) 作腹腔内注射.
2. 定位:将麻醉动物头部固定在立体定位仪上, 在无菌条件下切片开头颅皮肤将膜向两边, 用蜡充分止血, 暴露颅顶, 用墨汁标出前囱与后囱, 并调正头位使大白鼠前囱高于后囱1.0毫米(兔子前囱高于后囱1.5毫米), 最后在颅顶上钻孔, 挑破脑膜, 彻底止血.
3. 注酶:将称好的HRP 置小玻璃皿内, 用生理盐水稀释成10-50%浓度, 以1 微升容量的注射器吸取0.1-0.5微升, 然后把微量注射器固定在定位仪上, 剌入预定的脑局部, 注射时间10-15分钟. （平均速度０。０１微升、１－２小时分钟）， 注射完至少留针３０分钟。
4. 灌注:动物存活24-72小时后, 在醚麻醉下进行心脏内灌注固定. 将动物固定手术台上, 在心尖附近逐层切开, 进入胸腔, 剪开心包, 灌注针剌入左心室心尖部, 然后在右心房剪一小孔以便血液流出.
灌注时先用接近体温的生理盐水, 经200 克左右的大白鼠为例生理盐水约200-500毫升, 然后使用约4℃左右的固定液, 固定液量不少于200毫升. 灌注液高度约高于动物水平4-5尺. 灌注固定液:
多聚甲醛 2克
戊二醛 6毫升
0.1M磷酸缓冲液(PH7.2-7.6) 494毫升
将磷酸倒入盛有多聚甲醛烧杯内, 煮沸, 搅拌使之溶解, 待冷后倒入戊二醛并置4℃冰箱内保存.
5. 后固定:迅速开颅取脑, 剥去硬脑膜, 并将脑切成数块, 放入含有蔗糖的后固定液中固定过夜. 第二于早晨用浓蔗糖缓冲液浸洗半小时以上.
后固定液:
灌注固定液 40毫升
蔗糖 8克
浓蔗糖缓冲液:
0.1M磷酸缓冲液 40毫升
蔗糖 12克
6. 切片:连续冰冻切片, 片厚50微米, 每10片一并, 盛于含5%蔗糖磷酸缓冲液中. 5%蔗糖磷酸缓冲液配制:
蔗糖 5克
0.1M磷酸缓冲液 100毫升
配制后置于4℃冰箱内保存
7. 染色:切片置于孵育液中20-25分钟.
孵育液配制:(PH7.6)
Tris─盐酸缓冲液 20毫升
3,3'一二氨基苯胺(DAB) 10毫克
0.019% H2O2 0.1毫升
(本溶液于临用时配制).
Tris─盐酸缓冲液:
0.2Mris缓冲液 50毫升
0.2M盐酸储备液 38.4毫升
蒸馏水加至 200毫升
调整PH 在7.4-7.6备用.
0.019%H2O2配制:
以1毫升皮试注射针简抽取30%浓H3O2 0.13毫升用Tris ─盐酸缓冲液(PH7.4-7.6)稀释至1毫升, 从中取出6.1神毫升孵育液内即成.
8. 蒸馏水略洗, 贴片待干.
9. 二甲苯透明, 树胶封片观察
结果:被标记神经原的经胞质和近端树突中含有棕色或棕黑色细颗粒. 如在暗视野显微镜下观察, 这些棕黑色细颗粒则呈细亮点.( 请注意与含有较粗颗粒的结缔组织细胞和血管内皮加以区别.)
B. 辣根过氧化酶HRP 离子透入法.
离子透入法主要是应用玻璃微电极替微量注射器, 其它操作基本相同, 透离子方法具体如下:
将纯度高于2.5(R2.5+)以上的HRP 称好后置于小玻璃皿内, 用0.1M 盐酸稀释成10-25%浓度, 选择用尖端外径粗80-120微米的玻璃微电极(管内有玻璃细丝) 细心吸取酶液后, 把微电极枘固定位仪上, 接一细银丝或不钢丝插入玻璃电极中, 使金属丝尖端与酶接触, 此即作为电流正极, 切开皮肤部位作为阳极, 并与" 微电泳仪" 接通, 将电极剌入预定的脑部位. 通电7-15秒, 电流强度调节在2-4微安(uA):停电7-15秒, 交替进行共30分钟, 然后留针5-10分钟后, 取出微电极.
其它步骤同微量注射法.
*注:①操作过程中, 特别是插入微电极前必须彻底止血, 决不能让微电极尖端进入血液, 否则透导离子受阻, 将使实验失败. 另外, 微电极或量注射器抽取酶液以后一定要擦净外面的酶液, 以免针道污染.
②酶液注射速度不宜过快, 因为脑组织较致密, 注射过快局部脑组织受压迫, 将引起损伤. 同时酶液也会循针道外溢而影响结果, 注射酶液后至少留针30分钟, 使之充分吸收, 免出针时将酶液随血流出.
③在离子透入法实验中, 使用酶液浓度过高( 例如使用纯度为2. 9, 浓度50%)离透效果反而不好, 主要是酶浓度过高所产生的离子反而少. 另外, 电流过高也易引起脑组织产生电流性毁损. 应用上述电流强度, 盐水浓度和酶液浓度, 离透直径约0.5-2.0毫米范围, 标记细胞虽不如微量注射的多, 但标记细胞清晰.
④灌注固定动物脑, 有一定硬度后即可, 后固定时间不宜太长, 否则易导致酶失活, 但若灌注固定不良, 可将动物脑切成数小块, 改用冷20%福尔马林绶冲液代替稀固定液, 固定5-6小时, 其它步骤同前.
⑤灌注固定后取出脑, 作标准冠状切面时, 应将脑背面皮层平放于滤纸上, 然后垂直于矢状沟作切面.
参考文献:
1. W.Bruce warr et al ( 1931) in 《Neuroanatomical Tract- Tracing Methods》chap 6.Stephen T.Kitai and Georgia A.Bishop chap 7. Qswald Steward,.chap 8.
2. Spencer, Lynch & Jones( 1978) in 《Nenroanatomical Research Techniguds 》chap 10.
3. Lavain(1975)in 《The Use of Axonal Transport for Studies of Neuronal Conneei ctivity》
4. Lynch et al (1974)Brain Res 66:3337-341.
5. Malmgren(1978)Brain Res 148:279-294.
6. Gilbert & Wiesel(1979) Nature 280:120-125.
7. 杜草民主编《实用组织学技术》.
8. 家秀等(1980)《生物化学与生物物理进展》(5).
实验六、 细胞内注射HRP 观察水蛭神经节内的感觉和运动内的感觉和运动神经 元形态
(一) 目的与原理
注射到细胞内的HRP 通过轴突运输可以很快地布满整个神经元, 经组化呈色反应将整个神经元的结构清楚，精细的显示出来，这是目前生理学研究中常用的手段。
低等无脊椎动物的神经系统的基本功能与高等脊椎动物是相同的, 但它们的结构简单得多, 单个神经元体积又大的多, 这就给细胞内记录和精确地研究一些基本的神经生物学问题例如学习记忆提供了理想的实验材料, 而且还大大降低了对实验技术设备的要求, 又能获得很好的结果.
(二) 设备:
(1) 微电极记录系统
(2) 微电泳仪, 玻璃微电极.
(3) HRP.DAB H3O3等试剂.
标本:
水蛭(Leech)神经节(Segmental ganglion SG)
(三) 实验方法.
1. 注射HRP:手术取出水蛭SG 放在盛有生理盐水的器皿内, 并用钉子将SG 钉住. 用阻抗约100M Ω的玻璃微电极, 电极内为2%HRP(溶于0.1MKCl 中), 用压力注射5-30秒( 或用电泳). 在手术显微镜×100的监视下, 把电极插入SG 内的感觉神经元或运动神经元. 水蛭SG 的感觉和运动神经元分布如下图所示(Muller& MeMahan 1976)
固定:注酶后等30-90分钟, 将SG 固定30分钟. 固定液:0.8%戊二醛,1%多聚甲醛, 0.1磷酸缓冲液(PH7.0-7.3).然后用8%蔗糖液清洗15分钟.
3. 孵育:将标本浸入0.5%DAB液10分钟, ──加1滴3%H2O2/升(联苯胺液) 约1-5分钟, 在手术显微镜下观察呈色反应, 当兰色足够深时(即反应产物足够多时) ──8%蔗糖液冲洗──浸入15%硝基氰酸钠10分钟.
4. 脱水:100%乙醇1-2分钟──二甲苯1-2分钟.
5. 观察:用显微镜观察着色细胞的形状特征, 并画图. 如有条件可显微摄影。
参考文献:
1. Nicholls& Bayler(1968)J, Neurophy siol:31: 740-756.
2. Nicholls& Essen(1974)Scientific American:230(1):38-48.
3. Muller & MeMahan (1976)proc. R Soc B, 194:481-499.
4. kandel(1979) Sci.Am.241(3).
实验七、 PAP免疫酶染色技术
免疫酶定位染色法是把抗原──抗体反应专一性和显微形态学相结合的一种技术. 酶具有化学放大作用的特性, 而抗原一抗体又是高度专一性的反应系统, 因此免疫酶染色法在分
析细胞组成物质中具有灵敏度高, 特异性强的特点.
(一.) PAP免疫酶染色原理
HRP与抗体球旦白之间通过化学结合而形成的标记物, 可被未标记抗球旦白, 抗HRP 抗体和HRP 依次处理所代替. 即组织切片先用第一抗血清处理:洗涤后用抗球旦抗血清处理; 再与抗HRP 抗体反应; 紧后经HPO 和酶底物产生显色反应. 近年来已将抗HRP 抗体和HRP 预先制备成可溶性HRP ─抗HRP 免疫复合物(PAP)使染色过程中末标记抗球旦白处理后的抗HRP 抗体和HRP 的三步操作简化成PAP 一步处理.
这种方法通常称为非标记抗体酶技术, 或称抗体“搭桥”法. 非标记酶染色技术与酶标方法主要区别在于前者的各步骤(包括PAP 制备) 皆是免疫反应, 克服了酶标过程中酶和抗体活性减退等弊病.PAP 比抗HRP 抗血清和HRP 先后依次染色敏感20倍. 还应该指出, 非标记酶染色法所用的抗HRP 抗血清需要在制备第一抗血清的同种动物中产生. 例如第一抗血清若在兔子中产生, 则抗HRP 抗血清也在兔子中制备. 因此, 未标记的抗球旦白在反应中起“桥”的作用. 故羊抗兔球旦白或豚鼠抗兔球旦白均可使用.
在酸碱度近中性条件下, 抗原和抗体可以形成不溶性抗原一抗体复合物, 然而这种复合物在抗原过量和较低PH 条件下又可成为可溶性抗原一抗体复合物.
(二) 仪器和试剂
(1) 冷冻高速离心机;PH 计; 透折袋; 电磁搅拌器.
(2) 切片机, 染色缸等.
(3) 兔抗HRP 抗血清;HRP;HCL, NaOH,PH7.2.0.01M磷酸缓冲的生理盐水(PBS)等 .
(三) 实验方法.
制备HRP ─抗HRP 可溶性复合物(PAP).
15ml免抗过氧化物酶(HPO)抗血清经16，000rpm 离心20分钟(4℃下) ，去沉淀. 逐滴加入0.5mg/mlHPO约5.5ml. 加毕后继续置室温缓缓搅拌1小时,16. 00rpm 离心20分钟, 沉淀用0.01MPH7.2 PBS 洗2—3次。在冰溶中加6m l 2mg/ml的HPO 至上述沉淀，然后滴加0.1N 和0.01N Hcl调PH 至2.3, 此时HPO ─抗HPO 复合物几乎完全溶解. ──16.000rpm 离心20分钟, 偶尔出现极少量不溶物质, 取上清液, 及时在水浴中用0.1N 和.0.01N NaOH调回PH 到
7.3-7.5
第二部分 神经组织学方法
前言
神经组织学(国外统称作" 神经解剖学"neuroanatomy) 是对人体或动物体神经系统的微细结构进行观察, 研究神经组织细胞的形态与构造(包括显微结构和亚显微结构), 以及细胞间相互联系, 它们发生与发展的科学.
在过去几十年内, 神经解剖学曾被认为一门僵老学科, 但自从电子显微镜发明以后, 神经解剖学已逐渐改变了过去的面貌, 特别是二十世纪七十年代以来, 由于神经生理学和神经化学为神经解剖学提供了一些新方法新概念(如萤光组织化学技术, 利用轴突原理的双标记技术, 突触概念, 免疫酶标技术.....), 使这个古老的学科获得了新的生机, 尤其是神经生理学与神经解剖学更紧密地结合起来, 探索神经系统的结构与功能以及它们的相互关系, 已成为神经生物学研究中最活跃的领域之一.
神经解剖学研究的问题一般可分两大类, 相对应的就有一些专门的技术(即神经组织学方法). 一类是研究神经组织一般形态结构的，相对应的方法有:Golgi法,Nissel 法，还有萤光组织化学等, 另一类是研究神经系统中的联系的, 相对应的方法有:Nauta( 纤维退化) 法:利用轴突运输的HRP 法,HRP ───萤光双标记,HRP ─放射自显影双标记, HRP─免疫酶双标记等:利用能量代谢的2DG 法; 体外组织培养方法..... 等等, 近年来由于与电生理手段的结合, 同于电子计算机的引入对神经系统的描述开始进入新的阶段, 例如三维图象的显
示, 利用CT 技术直接观察活的实验动物和人的活体组织结构.
二、 神经组织的处理过程及应注意事项.
神经组织学的基本方法和其它组织学方法相同, 必须先把有待研究的组织制成很薄的切片标本, 经过染色处理形成可供观察的图象在显微镜下进行观察, 研究. 神经组织染色处理的一系列过程虽然有的和处理其它组织相似, 但也有其特殊性, 应引起相当的重视否则会得不到应有的结果.
(一), 固定与固定剂
中枢神经系统(脑, 脑干与脊髓) 的固定根据需要可采取两种形式─整体固定法, 切块固定法.
(1) 整体固定法
当需要作整脑切片时, 用整脑固定法. 固定脑的容器要宽大(园缸较好), 用线扎住脑的基底动脉, 使脑倒悬于固定容器内, 各面都不应与容器壁接触, 以免受压变形. 脊髓的固定最好放在长形容器内, 使脊髓伸直. 如果在开颅前先自左心室或颈内动脉将固定剂灌注, 再取脑浸于固定剂内, 可有助于固定组织均匀迅速, 这种整体固定脑(连同小脑及脑干) 常需两周, 成人脑可长达1-2个月之久, 才能使脑组织变硬及固定良好.
(2) 切块固定法
新鲜脑组织切取材时, 应稍切厚些, 以便以后切片时受当时刀切面的影响. 现在采用的大部分新技术都先经固定液心脏灌流然后开颅取脑后切块再固定一或二天即可进行切片处理. 固定剂的选择首先决定于所用的方法及固定剂配方. 最常用的是10%甲醛( 福尔马林) 液或10%甲醛生理盐水液, 其它固定剂可见各种方法的具体要求.
(二), 切片
三种切片法(石蜡切片法, 火棉胶切片法, 冰冻切片法) 在神经组织技术上都较常用. 例如对一些神经末稍装置和溃变纤维的银染法和现采用的大部分新技术多用冰冻切片法; 大片的脑组织染色或镀银(Nissel法或Golgi 法) 以及髓鞘染色等多用火棉胶切片(常规及快速色埋法); 一些神经末稍装置多习惯用石蜡切片.
脑组织用石蜡色埋时, 浸蜡时间应稍长, 否则石蜡不易浸透. 用火棉胶色埋的脑组织, 除Golgi 镀银法及类似法以外，一般都需经充分的脱水和浸胶时间，Golgi 法(包括COX 法等)
因只需火棉胶起暂时的支持作用, 而且长时间的洒精脱水可致银(汞) 沉淀分解, 所以只要求火棉胶略浸入组织, 能达到切片的目的即可( 一般这类切片都较厚, 组织内部末浸透火棉胶也能切完整), 不需长时间在酒精或火棉内浸泡. 冰冻切片一般不需要媒介物的支持色埋, 但如需较大切片或松软易碎组织也可经明胶色埋后再切(组织经水洗后, 入5%,10%或20%明胶,24小时/37℃, 然后装于组织托上, 再浸入10%甲醛液内硬化, 即可冰冻切片).
除石蜡切片外, 火棉胶切片, 冰冻切片都无须贴于载破片上之后再操作染色. 较方便的办法是用直径10厘米玻璃培养皿盛装切片, 用烧扁头的玻棒或新毛笔捞取, 用吸水纸沾去多余水份或洒精等.
三). 应注意事项
1. 神经组织取材时动作要轻柔, 一般不要切取大块, 用洒精脱水时每级洒精的差度也不要太大.
2. 神经切片不要切很薄(如薄于10u). 如切薄片, 常会将要观察的结构切丢或分割成不成形的碎段.
3. 任何玻璃器皿, 尤其用于银染法的, 都应经清洁液浸洗后再用. 所有用过的玻璃器皿则应在未干的情况下立即洗净并浸泡于清洁液内.
4. 配制溶液应用蒸馏水. 配制硝酸银溶液最好用双重蒸馏水; 在溶解硝酸银后其溶液应清彻透明, 出现任何轻度混浊都应弃去不用.
5. 避免使用含金属离子(如铁筒盛装的) 洒精, 包括用无水硫酸铜脱水的无水洒精.
6. 试剂、染料一般不必大量配制贮存留用, 配制成溶液后以有色瓶盛装.
7. 夹取作镀银处理的组织块时, 避免用金属镊子, 如用金属镊时, 应在镊顶端沾溶蜡后再用. 捞取切片时用玻璃棒或新毛笔.
8. 准备一个小暗箱, 作室温镀金、银用.
9. 某些镀银或染色等过程要求在高于室温的恒温箱内进行几天; 这种温箱的质量应注意选择, 绝不能使用那种控制温度不稳定的产品.
10. 多参阅别人的报导资料, 吸取经验. 自已在操作过程中也要随时记录工作情况(例如时间、温度、试剂浓度以至水洗次数等) 。所得结果最好能通过显微摄影（用彩色摄影更好）拍照留底。
实验一、 神经元形态结构的观察
神经细胞是构成神经系统整个结构的基本单元，也是一个最基本的机能单位。由于神经元是一个高度分化的细胞，所以它具有一个独特的外形：除了具有细胞体外，还有丛状的树突和细长的轴突。又由于不同部位的神经细胞执行其功能的不同，形状变化差异很大，因此神经细胞的分类法很多，大致有以下几种：
锥体细胞（分布于大脑皮质 Ⅲ ，Ｖ层：Ｖ层以大、中型锥体细胞为主）。
(1)按胞体形状分 星形细胞（分布于脑和脊髓灰质内的神经胶质细胞
棱形细胞（主要分布于皮质的深层，大脑皮质第Ⅳ层中最多）。 颗粒细胞（分布于大脑皮质Ｉ、Ⅳ层和小脑皮质Ⅲ层）
(2)按细胞突起分 假单极细胞(脊髓神经节细胞)
多极细胞(小脑蒲金野氏细胞, 脊髓运动神经元).
运动神经元(皮层锥体细胞, 脊髓中多极细胞).
(3)按功能分 感觉神经元(胞体较小, 主要分布皮层II, III层中).
联络神经元(脊髓的中间神经元).
⑷按化学能分 5—HT 能
5多巴能 脑干部位多
去甲肾上腺能
多肽能 内腓肽 脑的其他部位
脑腓肽
神经元的躯体直径通常
1、胞外膜(membrane)
约为5毫微米厚, 由二层类酯分子组成. 不同的神经元膜结合各种特殊的蛋白质, 具有泵、通道、受体、酶和结构蛋白质等多种功能。
２、 (cell body )胞体
神经细胞胞体与其它细胞(肌肉细胞, 腺体细胞.....) 的区别有以下三个特征:
(1) 空泡状核. 神经细胞体核通常球状、较大、染色质颗粒细而分散，外观呈空泡状。 （２）核仁大而显著. 因为神经细胞没有分裂能力, 而它的代谢又如此之旺盛( 每天要消耗1/3蛋白质), 势必形成核大.
(3) 核周质有好多细胞器:a、尼氏体.(又称粗面内质网, 可用Nissel 法显示), 胞体内特多, 轴突和树突中少, 轴丘中没有. 不同神经元尼氏体的大小, 形状都不一样, 可能与细胞代谢有关.b 、光面内质网. 常与粗面内质网连续, 并伸入树突和轴突内，它与粗面内质网的区别是上面没有核蛋白质体, 被认为是迅速传递物质的结构.c 、高尔基氏体。环绕胞核分布，并可伸入树突主干。d 、线粒体. 呈颗粒或细杆状, 缩时摄影拍摄培养神经元时看到它的形状大小不时在改变. 线粒体内酶系特别多, 是蛋白质合成和分化的工厂.e 、微管和微丝. 微管直径约20-26nm, 壁厚6nm; 微丝直径约10nm, 高倍镜下也呈管状, 壁厚3nm. 它是较细的神经肌动蛋白聚合体, 这些微管、微丝在轴浆中松驰地平行排列，一般认为与神经元的运输有关。
就功能而言，胞体对输入信号加以整合并发出信号，另外也可接受输入信号，如轴突─胞体突触，即轴突信号输入给一组新神经元的胞体；此外，胞体还司理整个神经细胞的营养。
３。轴突(axon)
又称纤维, 每个神经元都有一个轴突, 它是发生及传递兴奋的一个结构. 电子显微镜观察在轴突离开细胞体的地方形成一个园锥形的突起称" 始节"(或称轴丘), 该部位嗜色性较差, 既无尼氏体也突触连结. 当神经细胞发生兴奋时轴丘部位的细胞膜最先去极化, 因此轴丘被认为是神经冲动(即动作电位) 的发源地.
所有的轴突都被许旺氏细胞色裹起来, 在一些情况下 ,许旺氏细胞简单地以一薄层包裹轴突, 通常被称为" 无髓纤维", 如交感神经的节后纤维, 内脏神经的感觉纤维, 它的传导速度比较慢 .在许多情况下, 许旺氏细胞在胚胎发育过程中自已绕于轴突, 形成多层紧密的绝缘称" 髓鞘"( 它的结构成分是髓磷脂) 髓鞘沿轴突每隔大约1mm 被一个狭窄的间隙所中断, 这间隙称" 郎飞氏结" 有髓纤维的传导速度快.
轴突内是一种很均匀的液体, 称" 轴浆"(Axoplasm),它与胞体内原生质相连, 关于它的化学结构正被广泛地研究, 根据目前了解它是一种硬的凝胶, 内含大量的K+, 少量的Na+、氯化物和一些蛋白质。
轴突的功能是将胞体发出的传出信号输送到轴突末稍，通过轴突末稍把信息再传递给一组新的神经元。
４。树突(dendrites)
各种神经元由于其执行功能的不同，形态结构有很大差异，具有各种特殊形态的树突，如小脑蒲式细胞树突似扁柏枝。
根据树突走向的不同又可分为顶树突及底树突. 顶树突垂直于皮层表面, 其末端在接近皮层表面的部位时不断分支构成分子层或丛状层. 底树突则在胞体周围分支。树突的表面密密地披着一层侧棘, 每个侧棘有一根极细的柄, 直径在1微米以下, 柄的末端呈球状隆起, 在电子显微镜下观察轴突末端与侧棘尖端接触可构成轴突─树突突触.
就功能而言, 树突的功能是接受输入信号.
(一) 实验目的:
通过幻灯片、切片的观察充分认识神经元是一个高度分化, 具有独特外形的细胞. 要求掌握显微镜下观察到的神经细胞的基本构造, 并熟悉电子显微镜显示的神经细胞的微细结构及胞体内各种细胞器的形态.
(二) 实验用品:
显微镜, 双筒解剖镜, 幻灯机, 幻灯片, 切片标本.
(三) 实验内容:
1. 幻灯片观察
(1) 神经元的基本形态
A 神经元模式图
B 哺乳动物神经系统中发现的神经元类型。
C 光学显微镜中显示的各种神经细胞的形态.
(2) 电子显微镜中拍摄的神经元构造
D 成年老鼠大脑皮层, 显示一个小锥体神经元的细胞体(主要显示各种细胞器)
E 成年老鼠的脊髓切面，显示了一个前角细胞的尼氏体。
F 老鼠的耳蜗核切面，显示细胞核内的色涵物.
G 成年老鼠的大脑皮层，显示一个锥体神经元的顶树突。
H 老鼠的视皮层, 显示大脑皮层神经丛中的树突.(原生质中含微管, 微丝, 线粒
体, 光面内质网等细胞器; 许多树突棘的剖面被显示, 且可观察到棘与轴突末稍形 成的突触.)
I 老鼠脊髓的前角, 显示运动神经元始节纵切面.
J 成年老鼠的大脑皮层, 对比显示轴突始节和轴突终末.
K 来自组织培养的一个交感神经元的生长锥电子显微镜照片.
N 显微镜下切片观察
(1) 人体或动物的整脑连续切片
观察了解脑中各核团及纤维束的排列概况.
(2)Nissel染色法显示的大脑皮层质切片
了解大脑皮质各区神经细胞构筑, 对照图谱观察区分大脑皮质六层细胞及排列特点.
(3) Golgi法浸染的大脑眼质切片
观察掌握大脑皮层中各类神经元的基本形态.
(4) Nissel法显示的小脑皮质切片(横切)
掌握小脑皮质的细胞构筑分为三层分子层, 蒲金野氏细胞层及颗粒层. 区分三层细胞的排列特点.
(5) Golgi法浸染的小脑皮质切片(横切)
观察掌握小脑皮质中各类神经元的形态, 特别注意蒲金野氏细胞的形态特征.
实验二、神经组的染色技术
组织通过固定、脱水、色埋、切片等一系统过程之后，制成菲薄的组织切片，这种切片如不经过任何色彩的浸染，只能根据组织内部各种物质的折射指数不同，从光线的明暗上使我们看到一些组织结构，但远不能满足观察的要求，因此一定要通过染色这步骤。
染料是一类有色的有机化合物，不但要有鲜艳的色彩，而且对于纤维或组织必须具有亲和力，能将各种组织成分染成不同的颜色。染色过程不外乎化学反应和物理现象或两者结合过程，但染色料与组织究竟怎样结合，有些现象目前仍不能作出合理解释，尚需进一步探讨。 １、化学反应
主张染色过程是化学反应者认为，其化学反应的基本原理是：根据细胞内不同化学成分对染料有不同的亲和力，因此细胞具有选择性的着色能力，使细胞的不同成分染成不同的染色。例如，细胞内的酸性物质（如核酸）易被碱性染料所染，因为它对碱性染料的亲和力很强。细胞内的碱性物质（如细胞质）易被酸性染料所染，因这它对酸性染料的亲和力很强。因此，当细胞在酸性染料中染色时是有染色能力的阴离子与细胞内的碱性物质相结合，即细胞质（碱性）能被酸性染料着色。反之细胞在碱性染材中浸染时，细胞内的酸性物质与碱性染料中有染色能力的阳离子相结合，所以细胞核（酸性）能被碱性染料着色。
此外，染液的ＰＨ值对染色在很大关系，一般碱性物质在ＰＨ值较低（酸性）染液内着色；酸性物质在ＰＨ值较高（偏碱）的染液内着色。
２、物理现象
主张物理学说者认为染色过程中无化学反应，而是物理的吸附作用，毛隙现象，吸附作用或称作用或称溶液作用。当组织浸于染液内，由于染液中分散的色素粒子的分子引力作用，使色素粒子被组织吸附而呈现颜色。另外，如用苏丹III 染脂肪组织，由于苏丹溶于脂肪之中（在水中不溶），因此它是一种溶解现象。
３、媒染剂、促染剂及分化剂
（１）媒染剂：是促进染色能力的，它与染料或组织相结合，使染料与组织发生染色现象。媒染剂多用于天然染料，如苏木精和卡红。
（２）促染剂：它与媒染剂不同，不参与染色反应，只是增强染色能力，如在美兰中加适当量的氢氧化钠，或在伊红内加少量冻醋酸，则可增强染色能力。
（３）分化剂：也称脱色剂，分色剂，鉴别剂。分化剂是用来脱掉组织或切片过染的染料而使用的试剂，使受染的组织染色适当，色彩清晰。一般地说，分化碱性染料可用稀的酸性溶液；分化酸性染料则用稀的碱性溶液，分化剂大致有以下几种：
a. 酸性分化剂, 一般多用冰醋酸或盐酸, 其浓度一般为0.1-1%的水溶液或70%洒精溶液. 组织在酸性溶液中吸附氢离子而带正电荷, 从而使带正电荷的碱性染料脱掉.
b. 媒染分化剂, 铁苏木精染色法中使用的铁钒即为媒染分化剂, 它在染色前起媒染 作用, 而染色后可用它脱色.
c. 氧化分化剂. 氧化分剂是一种弱漂白剂, 例如赤血盐及苦味酸, 能将切片所有染色无选择的脱掉, 但由于不同组织对染料的亲和力不同, 这样实际上将结合不牢的染料脱掉而保留一部分颜色. 如Weigert 髓鞘染色法中用赤血盐分色.
(一) 实验目的:
通过实验操作使同学掌握神经组织最主要的几种染色方法, 另外通过染色后显微镜检查, 进一步熟悉大脑, 小脑中各类神经元的形态.
(二) 原理:
Golgi染色是利用硝酸银和重铬酸钾化合的原理, 可在神经细胞质内产生极微细的沉淀, 从而把整个神经元形态显示出来. 它的特点是仅显示部分细胞及其突起, 所显示的部分细胞散在各处不同部位, 因此联系神经细胞各结构之间的关系比较易于观察. 本法的缺点是不易
掌握, 重复性不够理想.
Nissel法染色原理:尼氏体又名" 虎斑" 本系神经细胞体内含有的特异性嗜色质, 利用碱性染料(如甲苯胺兰, 焦油紫, 硫硅等可染出尼氏体. 它在各种神经细胞内形态不尽相同, 所以一般已习惯于借尼氏体来辨认或鉴定神经细胞的存在, 它们的分布以及是否发生病理性的改变. 尼氏法染色手续简单, 不会失败; 唯一缺点是易于退色, 其原因在于染料的不牢固性, 故切片在分色. 脱水占应充分用二甲苯洗去分色液及脱水液, 封片采用中性合成树脂并避免光保存, 这样可免于过早退色.
髓鞘染色法原理:髓鞘是一种磷脂, 它可使锇酸还原成金属锇而现黑色, 但锇酸使用有很多不便, 例如价格昂贵, 浸透性差等. 因此采用劳克坚牢兰(Luxol Fast Blue)染色法能较简便的 染髓鞘为鲜兰色.
(三) 实验用品:
切片机, 染色缸, 各种手术器械, 定时钟, 大白鼠脑
(四) 实验方法:
1. Nissel法染尼氏体(虎斑")
(1)给组织固定:杀死动物后快速开颅取脑( 切取2- ５毫米厚的组织块) , 固定于Carnoy 液; 或中性甲醛液(或甲醛生理盐水溶液);80%洒精;
(2)切片:将固定的组织块经脱水后用石蜡色埋(也可用火棉胶色埋), 石蜡切片8-10微米厚; 火棉胶切片可切成15-20微米.
(3)切片下行至水:(石蜡切片)
二甲苯 1-2分钟
1/2(纯洒精+二甲苯 1分钟
95%洒精 1分钟
80%洒精 1分钟
70%洒精 1分钟
蒸馏水洗 片刻
(4)在下液中染色20-30分钟(如60C 温度箱染色则约3-10分钟), 然后蒸馏水洗. 焦油紫 0.1克
蒸馏水 99毫升
1%冰醋酸水溶液 1毫升
(5)用95%洒精分色. 分色时应注意控制, 既不使分色不足, 也不使其过度; 一般稍分色不足则对以后操作有缓冲作用.
(6)经无水洒精数次, 二甲苯内充分洗涤使尽重洗除洒精.
(7)中性树脂封片, 盖片.
(8)显微镜检查.
结果:尼氏体呈紫色
细胞核呈淡紫色
注:①焦油坚牢紫Cresyl Fast Vilet及硫硅均可代焦油紫. 硫硅更适于洒精固定的组织. ②切片分色也可在0.1%伊红,95%洒精溶液内进行, 结果纤维等被染成淡红色.
③对火棉胶切片, 可将染液再按1:10用1%醋酸水溶液稀释, 染色过夜, 然后水洗, 分色. 2 灌注的快速Golgi 法
(1)从动物左心室灌注0.5%亚硝酸钠的生理盐水溶液, 灌注时应打开静脉( 或右心房剪一小口) 放血. 亚硝酸钠的作用是便小血管扩张, 易于使固定剂达到各血管末稍部位. 灌注至血色消失即止.
(2)大量10%甲醛生理盐水继续灌注, 至静脉流出液无色且可嗅出甲醛气味.
(3)继续用下液灌注, 此液主要起媒染作用, 便细胞易于与银亲和.
水合氯醛 50克
重铬酸钾 50克
溶解后加浓甲醛液 100毫升
最后加水至 1立升
(4)将脑剥离颅腔, 切取2-5毫米厚的组织块, 再静置于上液内放暗处3天(不必摇动).
(5)换入1%硝酸银水溶液, 暗处3天.
(6)急速火棉胶色埋切片(或冰冻切片), 厚100-150微米, 切片浸于2%重铬酸钾内.
(7)急速水洗, 吸水纸沾净,100%洒精脱水, 经冬绿油(或木馏油─甲苯─石碳酸) 透明.
（8）经甲苯冲洗数次后即可用合成树脂封片或加盖玻片（最好不加）
(9)显微镜检查.
结果:神经细胞胞体、轴突、树突（可见到树突上的棘及小芽结构）都呈黑色，背底为淡黄色。神经胶质细胞（以星状胶质细胞出现率最高）。毛细血管周细胞等都能显示。 此方法对成年组织无选择性，效果较可靠。
３、Holmes 法染神经原纤维.
此方法也是利用神经组织对银的反应, 然后还原或" 显影",
(1)组织经10%甲醛固定或灌注.
(2) 流水冲洗12小时或更长, 脱水后石蜡色埋切片.
(3)切片烘干后脱蜡" 下行" 至水(具体操作同前).
(4)在20%硝酸银液内1小时(室温, 暗处).
(5)换三次蒸馏水, 共10分钟(或冲洗).
(6)在下液内镀银12-24小时(37C).对每一切片的银液量要不少于20毫升.
先配Holmes 硼酸──硼砂缓冲液.
A. 硼酸 12.368克(M/5)
蒸馏水 1000毫升
B. 硼砂 19.071克(M/5)
蒸馏水 1000毫升
取A 液55毫升+B液45毫升,PH=8.4,用蒸馏水稀释至494毫升. 加入1%硝酸银1毫升, 再加10%吡啶水溶液5毫升. 摇荡混合, 新鲜使用.
(7)取出切片甩去多余银液, 浸入还原液2-3分仲. 还原液配制如下:
对苯二酚 1克
无水亚硫酸钠 5克
蒸馏水加至 100毫升
(8)流水冲洗3分钟, 再换蒸水洗一次.
(9)0.2氯化金液调色3分钟, 水洗.
(10)入2%草酸水溶液3-10分仲, 至神经细胞逐渐由红变成深红, 最后呈黑色. 水洗, 并固定于5%硫代硫酸钠液5分钟, 充分水洗.
(11)脱水, 透明, 封片.
(12)显微镜检查.
结果:神经细胞及纤维均为黑色.
注:①在2%草酸液内调色至暗红色较好.
②切片如在水洗后脱水至95%洒精时, 也可用劳克坚牢兰(Luxol Fast Blue)复染髓鞘. 劳克坚牢兰 0.1克95%洒精溶液
染1小时,(37℃)
95%酒精洗，入蒸馏水。
0.5-1%碳酸锂分色, 再在70%洒精内继续分色至灰质与白质分清.
水洗, 脱水, 透明, 封片.
结果:细胞呈暗红色:纤维黑色; 髓鞘兰色.
4. 劳克坚牢兰─焦油紫同时染髓鞘及尼氏体法.
此方法较简便, 同时能染尼氏体, 很适合教学用.
(1)组织经10%甲醛固定, 石蜡切片" 下行" 至水.
(2)在劳克坚牢兰液内染色1-3小时, 室温或55-60温箱内进行(可延长至12小时). 劳克坚牢兰 0.1克
95%洒精 100毫升
10%冰醋酸 0.5毫升
混合后过滤使用.
(3)水洗后在0.05%硫酸锂水溶液内分色约1分钟, 再以70%洒精最后分色至背景无色.
(4)水洗后, 经焦油紫液染尼氏体, 室温15分钟.
0.1%焦油紫水溶液 40毫升
10%冰醋酸水溶液 0.4毫升
(5)水洗,95%洒精分色. 或用下液分色.
95%洒精 90毫升
氯仿 10毫升
冰醋酸 3滴
（6）95%酒精洗两次，经无水酒精脱水，及二甲苯透明，树脂封片。
(7)显微镜检查.
结果:有髓纤维呈鲜兰色, 神经细胞的内尼氏体为紫色, 对比明显.
注:①如用1%中性红水溶液染尼氏体, 染色5分钟亦可.
②如改为冰冻切片则稍染焦油紫(约5-7分钟). 用水洗, 再按下法染油红0, 则溃变的有髓纤维可呈红色.
油红0 0.5克
异丙醇 100毫升
同时将上面储备液6分加蒸馏水4份，混合后略停约5分钟, 过滤. 染油红o 10-15分钟,70%洒精分色. 水洗, 甘油明胶封片.
结果:末变性有髓纤维兰色, 溃变有髓维纤红色, 尼氏体紫色, 核兰紫色.
*注:①染色结束后一定要在显微镜下他细观察, 检查自已染色是否达到要求, 同时通过显微镜观察, 进一步熟悉大脑, 小脑各类神经元的形态.
②, 由于学时数有限, 本科生可选择二种方法染色, 研究生四种方法最好操作.
实验三 中枢定位标记实验
（一）目的与原理
在使用电生理方法研究脑内某个核团细胞的胜利特性之后，为了验证所记录的电特性确实来自该核团细胞则需要找到电极尖端的所在，且对照图谱标定它的确切位置。本实验的目的即是用微电泳的方法把某种染料（如固绿Fast Green ）注入到脑内预定的部位，然后通过组织处理，切片，显微镜检查找到标记电极尖端的位置。
通过实验操作要求掌握微电极定位技术和微电泳技术，了解中枢定位标记的意义。
（二）设备和实验动物
设备：手术器械，定位仪，电泳仪，冰冻切片机 ，麻醉剂，固绿等试剂
实验动物：大白鼠（体重最好在200克以上）
（三）实验步骤
1． 动物麻醉。用乌拉坦（20%）水溶液）静脉注射，按动物体重计算通常用量为
0.5ml/100g，实际用量视动物状态而酌情处理，观察动物处于深睡状态，呼吸均匀，四肢松弛即可。
2． 打开脑颅，剥去硬脑膜（注意不让流血），然后把动物固定于立体定位仪上，校正
好微电极尖端三维零点。
3． 取刚拉制尖端约50μ的玻璃微电极（管内有纤维丝），灌入固绿溶液。
固绿 1克
蒸馏水 20毫升
充分溶解（可加热溶解）后过滤备用。
4 接好电极，参照图谱选取某核团，按图谱标出的三维空间数值将微电极插入恼内且
记录下电极尖端的位置。
5 电极末端接阳极，参考电极接皮肤切口处。通电15分钟，通电过程中一定要注意
检测电流强度，使电流强度维持在几个微安（通电开始时电流强度可以达到几十微安 ，很快下降，且可保持在几个微安值）
6 移动一下电极位置，重复上面过程再电泳一个点。
7 打开胸腔，心脏灌流。
A 先取生理盐水（内加3.8%柠檬酸钠以抗血液凝固）200—250毫升，在左心室剪一小口，从左心室插入主动脉，灌入溶液且在右心房剪一口让血液流出，待流出液无血色即停止灌流。
B 取10%福尔马林生理盐水继续灌流，到流出液中可嗅出甲醛气味，脑表面已变色即停止（约需200—250毫升）。
8 将脑剥离颅腔，剪去硬脑膜，然后放入盛有10%福尔马林液的容器内再固定20小时
左右（容器不能太小，溶液体积应是脑体积的10—20倍）。
9 连续冰冻切片（每片厚40-50微米），将切片贴于载玻片上，烘干，显微镜下检查
有否绿色标记点。
10 对照图谱观察标记点位置是否与所需标记的核团位置相吻和。
若注入HRP ，则切片后经染色可观察标记细胞的形态，以及它与其他神经元的联系。
实验四、钴盐法确微电极尖端位置
(一). 目的与原理
在使用微电极研究脑内单位(unit)的生理特性之后, 一个重要的问题是这个单位究竟属于那个核团, 在核团的什么位置? 回答了这个问题, 工作才更有说服力, 更有价值. 通过微电泳的方法把钴盐注射到脑内, 然后通过组织化学的方法就可找到电极尖端的确切位置, 这即是所研究单位的位置.
(二). 设备与标本
设备:(1)视野计和马达驱动的剌激图型.
(2)通用电生理记录系统.
(3)双目解剖显微镜.
(4)电泳仪.
(5)常规组织化学仪器:切片机, 染色缸等.
(6)玻璃绝缘的W 丝微电极.
(7)CoCl2,(NH4)2 S,甲苯酚紫试剂.
标本:青蛙视顶盖(在位).
(三). 实验步骤:
1. 在蛙视顶盖记录一个神经节(G)细胞末稍的放电或一个顶盖细胞的电活动.
2. 用微电泳方法注射Cocl2:电极尖端2-4u, 灌注2.5M Nacl 和50M Cocl2通过以正脉冲电流, 强度1-1.5uA, 波宽0.5秒, 频率1HZ, 电泳时间为20-30分钟.
3. 立即取出脑, 剥去硬脑膜, 浸入( NH4) 2S 液( 在10ml 任氏液中加0. 05- 0.1ml纯(NH4)2S)，45分钟后取出用任氏液冲洗, 然后固定于10%福尔马林中.
4. 经各级酒精脱水→石蜡色埋→切片(切片厚15u).
5. 将切片粘贴于载玻片上, 烘干, 且用甲苯酚紫复染.
6. 显微镜下观察, 仔细寻找在顶盖中很多兰紫色细胞核中一个黑色斑点(斑点直径约15-50u), 这就是电极尖端位置.
(四). 参考文献
1. Picman et al ,(1972)Seince 176,412-414.
2. 王书荣等(1981).
实验五、辣根过氧化酶ＨＲＰ微量注射与离子透入法。
I. HRP技术的简单介绍.
70年代初一种新的技术引入到神经解剖学, 这使人们对脊椎动物的脑的了解, 特别是关于各核团间的联系的知识有了几乎是瀑炸性的增加, 这就是辣根过氧化物酶(HRP)技术. 今天世界上不用这种技术的神经解剖与神经生理学实验室已经不多了.
HRP(Horseradish Peroxidase)辣根过氧化物酶是一种大分子的蛋白质, 分子量约40000道尔顿, 分子半径是3.0nm, 可用它作为示踪物. 自从它被( Kristensson et al 1971:Lavail and Lavail,1972) 引入以来已证明了:在中枢或外周神经系统中, 为了明确地识别或鉴定一个神经细胞体纤维突起的起源, 或为了清晰地展现整个细胞体(包括它的轴突和树突) 的形态是一个既可靠又灵敏的方法.
这个技术的基础是神经元内的物质运输, 俗称" 轴突运输" 这种运输可在两个方向上进行:正向运输(即从胞体──纤维末稍) 逆向运输(即从纤维末稍──胞体). 又由于HRP 可使联苯胺的衍生物与双氧水发生呈色反应(即氧化反应), 因此把含有HRP 的切片放在具有显色基团的溶液中, 则HRP 会呈色因而把神经元的形态清晰完整地呈现在我们眼前.
(一) HRP方法的三种基本应用;
(1) 突触输入源的识别
将HRP 注入轴突末稍区域, 由于这递送示踪物的吸收和逆向运输可以显示提供突触输入到注射区域的神经元胞体, 这种高灵敏度的组织化学方法的使用经常可以展现一个被标记神经元的全长度, 包括它的树突树, 轴突和轴突侧支. 另外,HRP 的递送还可能与另一种独立注入的第二标记物( 例如放射性标记物或萤光化合物有益地结合, 通过逆行双标记确定侧支投射的存在.
(2) 传出神经突起的确定
注入进灰质的HRP 可以导致示踪物被神经元胞体大量的吸收, 这些神经元在大量摄取后将通过轴突运输示物到它的突触末稍, 由于HRP 的呈色即能将神经元的传出通路呈现在我们面前.
(3) 类似Golgi 的神经元染色.
注入进灰质的HRP 可以在几分钟-几小时内导致实心地填充, 象Golgi 法一样浸渍神经细胞体, 树突和它们的部分轴突分支. 也可以将HRP 直接供给灰质, 神经束和外周神经中被切割的轴突, 通过顺向或递向运输导致细胞体和轴突稠密地填充, 因而展现整个神经细胞的形态.
(二) HRP的结合和运输
A. HRP的特性
辣根过氧化物酶HRP 是一种含有正铁血红素基团的糖蛋白, 这种正铁血红素基团对于它的组织化学活性是基本的. 当它的基质(过氧化氢H2O2) 存在时,HRP 能催化一些化合物(联苯胺的衍生物) 的氧化作用 ,因此产生一种可见的反应产物.
大多数商业来源的HRP 含有几种与酶或同功酶近似相关的混合物, 因此HRP 最好事先纯化, 使其较稳定, 可以先配制好保存在5℃以下数天也不会变质.
B. HRP的扩散
HRP分子是足够小的, 当用心室内注射的方法引入无损伤的脑中时, 它通过细胞外空间以大约0.5mm/小时的最小速率扩散. 直接HRP 注入进脑中导致的酶扩散, 能从酶的释放位置扩散几个毫米到几个厘米, 扩散变化的程度取决于注入的量, 注入的速度，机械损伤的程度和发生脑水肿的程度. 通常注入后几小时内明显地扩散, 大约18- 24小时后扩散开始缩减,5-7天之后消失, 据1979年phillipson 报导, 随着离子电泳的释放,HRP 扩散斑点在4小时内达到最大尺寸, 而24小时后这个直径将收缩到约1/3.
C HRP的渗入
(1) 通过末稍HRP 的吸收
当注入的HRP 被无损伤地递送时, 示踪物主要通过突触末稍( 包括感觉神经节细胞的外周端) 摄取. 电镜研究显示了, 在注入后的不同时间内,HRP 依次出现在胞饮泡, 膜状囊和膜状管中以及多泡中和致密体(即溶酶体) 中. 随着注射后较长时间间隔HRP 又以相同的顺序从这些成分中消失.
通过末稍的HRP 的吸收是直接和它们的突触活动相联系的, 例如用控制突触活动的方法则HRP 的吸收会明显地减少, 抑制的方法有：用系统的戌巴比妥(pentobarbital),或将来自神经元输入的兴奋性迁移; 另外还可以通过剌激使吸收增加. 一般, 生长期的细胞HRP 最容易被摄取.
(2) 通过轴突HRP 的吸收
用电镜研究取得的一个十分出色的成果是:HRP能被轴突(特别是有髓轴突) 胞饮. 用光学显微镜的研究指示:示踪物可以瞬时的进入外伤的轴突（如注入场所的轴突），然后向近侧和远侧移动. 显著地, 被摄取的HRP 通过这些被损伤的轴突向外扩散, 因此在注入24 小时后示踪物很少再能在它们的母细胞体或它们末稍分板中被观察到. 被遭到压榨或切割而严重受损伤的轴突能大量地摄取HRP, 轴突邻近残肢中的大量示踪物最终被运输到核周体而给溶酶体降解掉; 远侧残枝中的HRP 则被运输到突触端, 并当这轴突不可避免地遭受华勒氏变性(断离神经纤维的脂肪变性) 时,HRP 最终被吞噬。
被损伤轴突的顺向和逆向示踪物填充能确立神经束的起端, 末端和端外周神经. 然而, 在严格地轴突通道中运输的HRP 能导致神经元核周体和轴突稍的标记.
(3)逆向轴突运输
HRP的逆向运输似乎依赖于微管的完整, 因为当使用秋水仙素和长春花这类微管阻滞剂时, 能阻断HRP 向核周体方向的递送.
被HRP 标记的微管, 液囊, 囊泡运到胞体后通常累积在具有Golgi 复合物的核周区域内, 然后随着互相扩散而形成较大的结构, 通常被认为液泡, 多泡体和致密体(即溶酶体), 整个胞体(包括树突) 最后可以充满载有HRP 的溶酶体. 大约3 天后随着酶降解，溶酶体中的HRP 量显著地减少:4-8天之间大多数溶酶体排空HRP.
用比较不灵敏的DAB 方法是温血动物轴突中测得逆向运输速率约70-120mm/day范围内:而在冷血动物中, 它的运输速率是相当慢的.
(4) 通过细胞体的吸收和顺向轴突运输.
HRP通过神经元胞体的直接吸收几乎只发生在注入场所或附近高浓度的区域. 被胞体的吸收的HRP 即被递送到溶酶体, 在那里它被逐渐地降解. 当发生HRP 整块大量的流入时, 那末就将随之发生明显的顺向运输, 而且可以被检测到.
科学家们普遍认为HRP 的顺向运输是和快速轴浆流动有关, 例如Mesulam and Mufson(1980)使用灵敏的TMB 方法在老鼠神经节细胞轴突中测得HRP 顺向运输的速率至少每天300mm.
(三). 方法学
A. 麻醉剂的选择
系统麻醉剂对HRP 的吸收与轴突运输的影响仅仅刚开始在探索, 然而初步的研究证明了在足够剂量水平时,HRP 的吸收与运输现象都能被戌巴比妥抑制。例如Rogers et al在老鼠体内实验发现:当把HRP 供给运动物迷走神经之后, 对动物施以50mg/kg的戌巴比当(相当高的剂量), 结果能减小逆向细胞标记和顺向轴突标记.(同使用乌拉坦相比较, 乌拉坦的用量为
1.5g/kg)
B注入酶的方法
最通常使用压力注入法或电泳法注入酶.
(1) 压力注入法
当使用这种方法时,HRP 通常被溶解在蒸馏水, 无菌盐水, 或磷酸缓冲盐水中( 4-50%的浓度). 扩散范围被注入的HRP 溶液的浓度和容量而增加, 大多数人使用0. 05-0.5ul(微升) 的容量. 据报导一个使用DAB 染色方法的资料中, 为了获得具有0.2- 0.5mm直径的扩散斑, 容量必须相当小约0.002-0.01ul(微升).
扩散斑的大小不仅和注入液的浓度和体积有关, 还和注入场所的组织特性有关, 例如一个给定的量普遍地在皮层下灰质比皮层组织产生的扩散区域大. 另外, 很明显地扩散斑的大小还随着使用的组织化学方法的不同而变化.
(2). 电泳注入法
为了达到较小的注入范围, 为了避免由于HRP 溶液的注入容量而引起组织损伤,Graybiel and Devor(1974)创立了一种递送HRP 的电泳方法. 大多数研究者用的电泳法的频率范围是5-0.07HZ; 电流范围是1-10uA
当电流低于1uA 时则不发生传递, 注入时间有小于5分钟, 或大于30分钟的;HRP 的浓度通常有10-50%
HRP电泳的设备是恒流源, 图A 即是一个具体的线路, 这种恒流源要有监视电流的功能, 因为注射过程中常常会发生电极尖端阻塞的现象.
注射用的电极一般要经过打尖处理, 尖端直径可1-100u 作细胞内注射的电极尖端要小约1-2u, 且必须进行研磨加工. 因为电极与HRP 注射关系较大, 所经一般要作准备性实验, 装置如图B 所示:Saline可用生理盐水或生理盐水──琼脂液, 注射电极接电源正极. 据报导为避免阻塞, 有人使用正泳冲电流(Gilbert and wiesel 1979). 通过这种准备性试验可以摸索一些实验条件, 还可选合适的电极.
(3) 轴突创伤后的标记法
在暴露的切割神经纤维端上用HRP 干粉或HRP 溶液都能达到标记. 这种方法产生顺向和逆向运输使HRP 注满轴突和胞体, 因此常被用来标记中枢神经束和外周神经纤维的起源和终止. C存活时间
最佳存活时间取决于轴突运送HRP 的速度, 所研究的纤维系统的长度, 以及一旦示踪物到
达细胞体后它的溶酶体的降解速度. 例如用DAB 已估计出HRP 逆输速度在50-120mm/day范围内, 但由于DAB 方法相当不灵敏所以实际的运输速率还要快一此. 其次, 注入区域中的神经末稍分支的密度和运送HRP 的速率也有关(运送HRP 的速度与纤维直径有关). 再其次, 系统的功能状态也决定着轴突末稍吸收HRP 的速率, 用电或其它剌激的方法可以加速HRP 的渗入和运送. 最大的细胞标记所需要的时间不仅只取决于HRP 的积累速度, 还取决于它被溶酶体(无活) 的变化速率. 因此, 要精确地给出某一纤维系统的最佳存时间是困难的. 需要通过实际试验. 目前大多数研究者在哺乳动物中常采用24-48小时的存活时间间隔; 冷血动物需的存活时间比较长, 约几天; 年青不成熟的动物由于在生长发育期轴突尖端有显著的胞饮活动, 所以最佳存活时间可稍微缩短.
D. 固定和切片
(1)固定
固定无疑是HRP 组织化学处理中最关键性的步骤之一, 为了达到提供最大的酶活性状态和减小扩散, 吸收与内生HRP 活性的二个参数必须予以特别的注意: 固定液的选择和固定的时间.
大多数的固定液都含有不同量的多聚甲醛和戊二醛, 但是也有许多研究者单独使用甲醛, 还有人用双倍醛.Courrille and Saint-Cyt(1978) 提出方法可执行外部预固定(即将动物先用6%葡聚糖灌流, 之后立即将脑取下浸在含氟里昂的烧杯, 再用液氮快速冰冻组织, 然后在一个低温控器上切片.
目前大多数研究者们采用的固定程序如下:先用一种含不同量蔗糖, 葡萄糖，葡聚糖的等渗NaCl 缓冲液灌流以冲去组织中的血液, 因为血细胞有内生的过氧化酶活性, 可以产生人工产物, 因此固定前先冲去血液是重要的. 接着用固定液灌流(通常灌15-30分钟). 然后 ,脑子被立即取出放入一个冷的(4℃)30%磷酸缓冲蔗糖液中后固定几小时, 为了保证内生过氧化物酶的失活. 或者还可以接着后固定将脑子放在保持4℃的蔗糖液中, 直到脑子沉到并底, 采用这蔗糖处理有三个目的:①排除过剩的固定液. ②用作一个低温防腐剂. ③降低以后染色中产生晶状人工产物.
(2) 切片
一般直接将组织放在低温控制器上切片, 但必要时组织也可用明胶或白旦白明胶色裹之后在冷冻切片机或低温控制器上切片. 由于不同色原的穿透力不同, 切片的厚度应随之变化, 例如BDHC 染色方法似乎穿透组织力较弱, 因此切片厚度不超过30-35微米, 而TMB 染色方法可切成50微米厚.
(四)HRP 的染色方法
为了产生HRP 组织化学反应, 切片组织被放在含有过氧化氢(双氧水) 和色原(通常是联苯胺衍生物) 的介质中孵育, 通过这过氧化物──过氧化物酶系统, 得到一种带色的产物. 最常使用的四种色原是: a. DAB( 3, 3` ─diaminocobezidine tetrahydrochloride) b. BDHC(benzidine dihydrochloride) C. TMB(3,3',5,5`te- tramethylbenzidine) d. O ─dianisine( 3, 3'dimethoxybenzidine
dihydrochloride)
A,DAB方法
DAB方法是证明神经元逆向轴突运输最通常使用的色原, 这方法的流行主要有以下几个因素:①DAB 方法技术简单. ②获得的结果容易被再复制. ③这方法产生的棕反应产物是嗜锇的, 因此DAB 染色材料可同时用作电镜研究④DAB 反应产物也是高度折射的, 因此可在暗视野光学显微镜下观察. ⑤当使用弥散注入时,DAB 产物通常能给出较清晰的神经元形态.
不足之处是这种棕反应物在产物在明视野显微镜中不容易看见, 而且在光学显微镜水平上DAB 方法的灵敏度不如BDHC 方法或TMB 方法.
B. O─Dianisidine 方法
Colman et al(1976)使用O-dianisidine(PH4.5),产生一种绿色的反应产物. 这种绿反应物在明视野光学显微镜中容易被观察, 此外在操作过程中发现使用o- dianisidine介质可同时充当低温防腐剂, 酶作用允许在0C 以下进行，因此酶的作用显然更好控制，然而可惜的是这绿反应产物很易退色.
C. BDHC方法
1974年Lynxh et al 介绍了一种用BDHC 作色原的束示踪方法, 用BDHC 作色产生物是兰色的, 在明视野显微镜中可见, 而且不象o-dianisidine 反应产物那样易退色. 但必须注意用BDHC 作色原由于使用的BDHC ─过氧化介质的PH 值不同可获得不同的颜色的反应产物; 而在酸性介质中易获得棕色反应产物, 而且二者的差别在暗视野显微镜中更为明显, 在酸性介质中获得的反应产物呈现微红色的银颗粒.
BDHC色原类似DAB 和似dianisidine 也是一种可疑的致癌剂, 因此处理这些基质时必须十分谨慎小心.
D.TMB方法1974年Holland et al 提出用TMB 作联苯胺代用品, 原因是①它明显的不致癌特性. ②认为TMB 比联苯胺更灵敏.TMB 反应产物在光学显微镜中很容易被观察, 在明视野显微镜中它呈现稍带点灰色的兰颗粒, 在暗视野显微镜中它呈现金黄色的颗粒.
尽管TMB 是一种有效的色原, 但很快研究者们发现TMB 存在以下的缺点:①TMB 反应产物易产生过度的结晶. ②反应时间不稳定. ③它不象DAB 反应产物那样亲锇, 而且TMB 反应产物对作电镜研究制备的组织本质上是高度可溶的有机溶剂. 由于存在这些不足, 因此TMB 方法对神经系统的实际应用被限制.
总的来说, 使用HRP 方法有以下优点:(1) 操作方法简单, 实验周期短(只需几天).(2)用此方法制成的标本可以同时作光学显微镜和电镜的研究( 在一个标本作连续超薄切片时隔一段取几张普通切片, 以作光镜对照观察).(3)对于生理学家来说, 这个方法的最大价值在于:它可以和微电极技术相结合, 和电生理观察密切地结合起来, 例如先对某一细胞的生理特性进行观察(观察细胞的电位变化, 研究细胞的电特性), 然后立即注入HRP 显示这细胞的形态结构, 或通过复染再显示这个细胞与周围细胞之间的关系. 所以HRP 技术是一种将生理和形态结合起来进行研究的比较好的方法.
尽管HRP 技术的引进还只有相当短的时间, 但此方法已成为神经科学研究中很好的特征工具. 近年来又出现了方法学的新阶段. 即为了某种特殊的需要采用二, 二特种技术相结合的" 双标记技术" 例如①使用Golgi 法与Nauta 纤维退化技术二者结合分析, 可用来研究神经元之间的联系. ②同时使用HRP 和萤光色素进行逆行标记, 可研究神经元的轴突投射. ③使用萤光色素和免疫组织化学相结合的免疫萤光技术, 可用来分析神经递质的分布. ④使用HRP 技术和放射自显影术相结合, 用[ 3H] 标记的[3H]─HRP 注入视皮层17区, 末标记的HRP 注入视皮层18区, 然后进行HRP 组织化学处理和自显影处理, 结果从HRP 反应产物和银颗粒标记中证明了在视皮层17,18 区存在的是外膝体细胞的侧技投射. ⑤使用体外组织培养技术和HRP 技术相结合, 可以在人工控制的条件下观察神经元的生长, 迁移过程, 吞饮HRP 过程, 以及视经元的退化过程等.
实验
(一) 目的原理
注入进脑灰质中的HRP 可被皮层中神经细胞体大量的吸收, 并通过轴突运输将HRP 运送到树突和轴突中, 经组织化学处理可展现神经元的形态.
通过实验操作初步掌握轴突运输原理在神经生物学中的应用, 在实验观察中要求和Golgi 染色法作比较, 用还HRP 技术显示的神经元形态的精确程度可以和Golgi 染色法相比较，优点在于它可以和微电极技术相结合, 了解神经细胞的功能与结构的关系.
(二) 设备
微量注射器, 微电泳, 立体定位仪, 解剖器械, 冰冻切片机.
HRP.3,'3G一二氨基苯胺(DAB),Tris液H2O2, 多聚甲醛等.
(三) 方法
A 辣根过氯化酶HRP 微量注射法.
1. 麻醉, 动物(大白鼠) 用10%乌拉坦(剂量为1克/10毫升/公斤) 作腹腔内注射.
2. 定位:将麻醉动物头部固定在立体定位仪上, 在无菌条件下切片开头颅皮肤将膜向两边, 用蜡充分止血, 暴露颅顶, 用墨汁标出前囱与后囱, 并调正头位使大白鼠前囱高于后囱1.0毫米(兔子前囱高于后囱1.5毫米), 最后在颅顶上钻孔, 挑破脑膜, 彻底止血.
3. 注酶:将称好的HRP 置小玻璃皿内, 用生理盐水稀释成10-50%浓度, 以1 微升容量的注射器吸取0.1-0.5微升, 然后把微量注射器固定在定位仪上, 剌入预定的脑局部, 注射时间10-15分钟. （平均速度０。０１微升、１－２小时分钟）， 注射完至少留针３０分钟。
4. 灌注:动物存活24-72小时后, 在醚麻醉下进行心脏内灌注固定. 将动物固定手术台上, 在心尖附近逐层切开, 进入胸腔, 剪开心包, 灌注针剌入左心室心尖部, 然后在右心房剪一小孔以便血液流出.
灌注时先用接近体温的生理盐水, 经200 克左右的大白鼠为例生理盐水约200-500毫升, 然后使用约4℃左右的固定液, 固定液量不少于200毫升. 灌注液高度约高于动物水平4-5尺. 灌注固定液:
多聚甲醛 2克
戊二醛 6毫升
0.1M磷酸缓冲液(PH7.2-7.6) 494毫升
将磷酸倒入盛有多聚甲醛烧杯内, 煮沸, 搅拌使之溶解, 待冷后倒入戊二醛并置4℃冰箱内保存.
5. 后固定:迅速开颅取脑, 剥去硬脑膜, 并将脑切成数块, 放入含有蔗糖的后固定液中固定过夜. 第二于早晨用浓蔗糖缓冲液浸洗半小时以上.
后固定液:
灌注固定液 40毫升
蔗糖 8克
浓蔗糖缓冲液:
0.1M磷酸缓冲液 40毫升
蔗糖 12克
6. 切片:连续冰冻切片, 片厚50微米, 每10片一并, 盛于含5%蔗糖磷酸缓冲液中. 5%蔗糖磷酸缓冲液配制:
蔗糖 5克
0.1M磷酸缓冲液 100毫升
配制后置于4℃冰箱内保存
7. 染色:切片置于孵育液中20-25分钟.
孵育液配制:(PH7.6)
Tris─盐酸缓冲液 20毫升
3,3'一二氨基苯胺(DAB) 10毫克
0.019% H2O2 0.1毫升
(本溶液于临用时配制).
Tris─盐酸缓冲液:
0.2Mris缓冲液 50毫升
0.2M盐酸储备液 38.4毫升
蒸馏水加至 200毫升
调整PH 在7.4-7.6备用.
0.019%H2O2配制:
以1毫升皮试注射针简抽取30%浓H3O2 0.13毫升用Tris ─盐酸缓冲液(PH7.4-7.6)稀释至1毫升, 从中取出6.1神毫升孵育液内即成.
8. 蒸馏水略洗, 贴片待干.
9. 二甲苯透明, 树胶封片观察
结果:被标记神经原的经胞质和近端树突中含有棕色或棕黑色细颗粒. 如在暗视野显微镜下观察, 这些棕黑色细颗粒则呈细亮点.( 请注意与含有较粗颗粒的结缔组织细胞和血管内皮加以区别.)
B. 辣根过氧化酶HRP 离子透入法.
离子透入法主要是应用玻璃微电极替微量注射器, 其它操作基本相同, 透离子方法具体如下:
将纯度高于2.5(R2.5+)以上的HRP 称好后置于小玻璃皿内, 用0.1M 盐酸稀释成10-25%浓度, 选择用尖端外径粗80-120微米的玻璃微电极(管内有玻璃细丝) 细心吸取酶液后, 把微电极枘固定位仪上, 接一细银丝或不钢丝插入玻璃电极中, 使金属丝尖端与酶接触, 此即作为电流正极, 切开皮肤部位作为阳极, 并与" 微电泳仪" 接通, 将电极剌入预定的脑部位. 通电7-15秒, 电流强度调节在2-4微安(uA):停电7-15秒, 交替进行共30分钟, 然后留针5-10分钟后, 取出微电极.
其它步骤同微量注射法.
*注:①操作过程中, 特别是插入微电极前必须彻底止血, 决不能让微电极尖端进入血液, 否则透导离子受阻, 将使实验失败. 另外, 微电极或量注射器抽取酶液以后一定要擦净外面的酶液, 以免针道污染.
②酶液注射速度不宜过快, 因为脑组织较致密, 注射过快局部脑组织受压迫, 将引起损伤. 同时酶液也会循针道外溢而影响结果, 注射酶液后至少留针30分钟, 使之充分吸收, 免出针时将酶液随血流出.
③在离子透入法实验中, 使用酶液浓度过高( 例如使用纯度为2. 9, 浓度50%)离透效果反而不好, 主要是酶浓度过高所产生的离子反而少. 另外, 电流过高也易引起脑组织产生电流性毁损. 应用上述电流强度, 盐水浓度和酶液浓度, 离透直径约0.5-2.0毫米范围, 标记细胞虽不如微量注射的多, 但标记细胞清晰.
④灌注固定动物脑, 有一定硬度后即可, 后固定时间不宜太长, 否则易导致酶失活, 但若灌注固定不良, 可将动物脑切成数小块, 改用冷20%福尔马林绶冲液代替稀固定液, 固定5-6小时, 其它步骤同前.
⑤灌注固定后取出脑, 作标准冠状切面时, 应将脑背面皮层平放于滤纸上, 然后垂直于矢状沟作切面.
参考文献:
1. W.Bruce warr et al ( 1931) in 《Neuroanatomical Tract- Tracing Methods》chap 6.Stephen T.Kitai and Georgia A.Bishop chap 7. Qswald Steward,.chap 8.
2. Spencer, Lynch & Jones( 1978) in 《Nenroanatomical Research Techniguds 》chap 10.
3. Lavain(1975)in 《The Use of Axonal Transport for Studies of Neuronal Conneei ctivity》
4. Lynch et al (1974)Brain Res 66:3337-341.
5. Malmgren(1978)Brain Res 148:279-294.
6. Gilbert & Wiesel(1979) Nature 280:120-125.
7. 杜草民主编《实用组织学技术》.
8. 家秀等(1980)《生物化学与生物物理进展》(5).
实验六、 细胞内注射HRP 观察水蛭神经节内的感觉和运动内的感觉和运动神经 元形态
(一) 目的与原理
注射到细胞内的HRP 通过轴突运输可以很快地布满整个神经元, 经组化呈色反应将整个神经元的结构清楚，精细的显示出来，这是目前生理学研究中常用的手段。
低等无脊椎动物的神经系统的基本功能与高等脊椎动物是相同的, 但它们的结构简单得多, 单个神经元体积又大的多, 这就给细胞内记录和精确地研究一些基本的神经生物学问题例如学习记忆提供了理想的实验材料, 而且还大大降低了对实验技术设备的要求, 又能获得很好的结果.
(二) 设备:
(1) 微电极记录系统
(2) 微电泳仪, 玻璃微电极.
(3) HRP.DAB H3O3等试剂.
标本:
水蛭(Leech)神经节(Segmental ganglion SG)
(三) 实验方法.
1. 注射HRP:手术取出水蛭SG 放在盛有生理盐水的器皿内, 并用钉子将SG 钉住. 用阻抗约100M Ω的玻璃微电极, 电极内为2%HRP(溶于0.1MKCl 中), 用压力注射5-30秒( 或用电泳). 在手术显微镜×100的监视下, 把电极插入SG 内的感觉神经元或运动神经元. 水蛭SG 的感觉和运动神经元分布如下图所示(Muller& MeMahan 1976)
固定:注酶后等30-90分钟, 将SG 固定30分钟. 固定液:0.8%戊二醛,1%多聚甲醛, 0.1磷酸缓冲液(PH7.0-7.3).然后用8%蔗糖液清洗15分钟.
3. 孵育:将标本浸入0.5%DAB液10分钟, ──加1滴3%H2O2/升(联苯胺液) 约1-5分钟, 在手术显微镜下观察呈色反应, 当兰色足够深时(即反应产物足够多时) ──8%蔗糖液冲洗──浸入15%硝基氰酸钠10分钟.
4. 脱水:100%乙醇1-2分钟──二甲苯1-2分钟.
5. 观察:用显微镜观察着色细胞的形状特征, 并画图. 如有条件可显微摄影。
参考文献:
1. Nicholls& Bayler(1968)J, Neurophy siol:31: 740-756.
2. Nicholls& Essen(1974)Scientific American:230(1):38-48.
3. Muller & MeMahan (1976)proc. R Soc B, 194:481-499.
4. kandel(1979) Sci.Am.241(3).
实验七、 PAP免疫酶染色技术
免疫酶定位染色法是把抗原──抗体反应专一性和显微形态学相结合的一种技术. 酶具有化学放大作用的特性, 而抗原一抗体又是高度专一性的反应系统, 因此免疫酶染色法在分
析细胞组成物质中具有灵敏度高, 特异性强的特点.
(一.) PAP免疫酶染色原理
HRP与抗体球旦白之间通过化学结合而形成的标记物, 可被未标记抗球旦白, 抗HRP 抗体和HRP 依次处理所代替. 即组织切片先用第一抗血清处理:洗涤后用抗球旦抗血清处理; 再与抗HRP 抗体反应; 紧后经HPO 和酶底物产生显色反应. 近年来已将抗HRP 抗体和HRP 预先制备成可溶性HRP ─抗HRP 免疫复合物(PAP)使染色过程中末标记抗球旦白处理后的抗HRP 抗体和HRP 的三步操作简化成PAP 一步处理.
这种方法通常称为非标记抗体酶技术, 或称抗体“搭桥”法. 非标记酶染色技术与酶标方法主要区别在于前者的各步骤(包括PAP 制备) 皆是免疫反应, 克服了酶标过程中酶和抗体活性减退等弊病.PAP 比抗HRP 抗血清和HRP 先后依次染色敏感20倍. 还应该指出, 非标记酶染色法所用的抗HRP 抗血清需要在制备第一抗血清的同种动物中产生. 例如第一抗血清若在兔子中产生, 则抗HRP 抗血清也在兔子中制备. 因此, 未标记的抗球旦白在反应中起“桥”的作用. 故羊抗兔球旦白或豚鼠抗兔球旦白均可使用.
在酸碱度近中性条件下, 抗原和抗体可以形成不溶性抗原一抗体复合物, 然而这种复合物在抗原过量和较低PH 条件下又可成为可溶性抗原一抗体复合物.
(二) 仪器和试剂
(1) 冷冻高速离心机;PH 计; 透折袋; 电磁搅拌器.
(2) 切片机, 染色缸等.
(3) 兔抗HRP 抗血清;HRP;HCL, NaOH,PH7.2.0.01M磷酸缓冲的生理盐水(PBS)等 .
(三) 实验方法.
制备HRP ─抗HRP 可溶性复合物(PAP).
15ml免抗过氧化物酶(HPO)抗血清经16，000rpm 离心20分钟(4℃下) ，去沉淀. 逐滴加入0.5mg/mlHPO约5.5ml. 加毕后继续置室温缓缓搅拌1小时,16. 00rpm 离心20分钟, 沉淀用0.01MPH7.2 PBS 洗2—3次。在冰溶中加6m l 2mg/ml的HPO 至上述沉淀，然后滴加0.1N 和0.01N Hcl调PH 至2.3, 此时HPO ─抗HPO 复合物几乎完全溶解. ──16.000rpm 离心20分钟, 偶尔出现极少量不溶物质, 取上清液, 及时在水浴中用0.1N 和.0.01N NaOH调回PH 到
7.3-7.5