食品微生物学
实验一 生物显微镜的构造和使用实验
一、目的与要求
（1）学习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。
（2）观察并学会拍下现成的标本玻片在显微镜下显现的图像。
二、原理
普通光学显微镱由机械装置和光学系统2大部分构成。在光学系统中，物镱的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的几种物镱以油镱的放大倍数最大，与其它物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。
三、材料与仪器
（1）材料 现成的标本玻片
（2）仪器 UB102i型生物显微镜（重庆奥浦光电技术有限公司），擦镜纸
四、操作步骤
（1）显微镜的安置
置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘3～4cm，镱检时姿势要端正。
（2）调节光源
安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镱采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜度调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。
（3）低倍镜观察
将标本玻片置于载物台上，用标本夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10×物镜，使其接过标本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起镜筒，出现图像后再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。
（4）高倍镜观察
在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，以聚光镜器光圈及视野进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。
（5）显微镜用后处理
1、上升镜筒，取下载片。
2、用擦镜纸擦去镜头上的残留物
3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。
4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。
五、实验结果
低倍镜下观察到的植物细胞组织
实验二 细菌培养基的配制
一、实验目的
1了解并掌握培养基的配制、分装方法；
2掌握各种实验室灭菌方法及技术。
二、实验原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基 的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜 的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
三、实验材料
1、实验仪器
电子称、称量纸、量筒、锥形瓶8个、培养皿及培养皿盒44个、试管30根、玻璃棒、烧杯、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、报纸、接种环。
B-260型恒温水浴锅 （上海亚荣生化器械厂）
YM型立式压力蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）
UB102i型生物显微镜（重庆奥浦光电技术有限公司）
BSP-100生化培养箱（细菌用）（上海博讯实业有限公司）
2、药品
平板计数琼脂 (广东环凯生物科技有限公司）
营养琼脂
无水乙醇 (广东环凯生物科技有限公司） （华东医药有限公司）
（杭州微生物试剂有限公司） 营养肉汤培养基
四、实验步骤
1 培养基的制备
1.1 称量
称取已经配好的营养肉汤粉、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。
1.2 溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量（沸水），用玻棒搅匀，然后，待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。因为是配制固体培养基，所以先将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。
1.3 过滤分装
用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。
过滤完后的培养基进行分装。因为要制作平板培养基，则须将培养基分装于锥形瓶内。 分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。
装入试管的培养基量，视试管和锥形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4毫升（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。
1.4 包扎
分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与姆指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞作成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。试管十个一捆。
1.5湿热灭菌（采用高压蒸汽灭菌法）
将上述培养基以1210C,20min,0.103MPa高压蒸汽灭菌。
高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学 实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到 121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。
1.6 制作平板培养基
将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入10毫升，以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15分钟左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，理论上24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物。
实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色
一、目的与要求
（1）掌握染色的原理和操作过程
（2）掌握简单染色和革兰氏染色法
（3）熟练显微镜的使用技术
二、原理
由于菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。 其过程是：
草酸铵结晶紫初染→路哥尔氏碘液媒染→95%乙醇脱色→蕃红花红复染。
若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌；
若被乙醇脱色而被蕃红复染成红色，则称革兰氏阴性菌。
三、实验仪器与药品
（1）实验仪器
载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、接种环、显微镜、镊子
（2）实验药品
革兰氏染色液（草酸铵结晶紫液＋路哥尔氏碘液＋95%乙醇＋蕃红花红）、蒸馏水、菌落培养物（培养18～24小时）、二甲苯、香柏油
四、操作程序
（1）简单染色法
① 涂片 取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。
② 干燥 室温自然干燥或略微加热干燥。
③ 固定 涂面朝上，快速通过火焰2—3次（勿使涂片烫手）。
④ 染色 滴染料，
⑤ 水洗 用自来水冲洗，直到涂片上流下的水无色为止。
⑥ 干燥 自然干燥或吸水纸吸干
（2）革兰氏染色法
涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染→水洗→碘液媒染→95%酒精脱色20~30秒→水洗→蕃红花红液复染→水洗干燥→镜检
1) 涂片：先滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，然后用接种环取少量菌体轻轻混入水中，涂成一
薄层并使细胞均匀分散。
2) 干燥：在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠近火焰。
3) 固定：把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌体细胞以及改变对
染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲洗脱落。
4) 初染：用草酸铵结晶紫液初染1min，水洗、吸干。
5) 媒染：加一滴路哥尔氏碘液媒染1min、水洗。（此时结晶紫与碘液成复合物）
6) 脱色：斜置载玻片，用95%酒精冲洗约20～30s，立即水洗，吸干。
7) 复染：用蕃红花红液复染1～2min，水洗晾干或用吸水纸吸干。
8) 镜检：在显微镜油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异，并观察菌体形态。
（三）革兰氏染色成败的控制点
① 涂片厚度：涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态，涂片过薄，细胞数量少，不利于观察；
② 染色时间。染色时间过长,结晶紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结晶紫尚未与细胞结合。染色控制不好，易引起误判；
③ 乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够，则阴性菌被误染为阳性菌。
五、实验报告
1. （一）结果 说明3株细菌的染色观察结果（形态、颜色革兰氏染色结果）。膜染色的示
范片
食品微生物学
实验一 生物显微镜的构造和使用实验
一、目的与要求
（1）学习普通光学显微镜的结构、各部分功能及使用方法。
（2）观察并学会拍下现成的标本玻片在显微镜下显现的图像。
二、原理
普通光学显微镱由机械装置和光学系统2大部分构成。在光学系统中，物镱的性能最为关键，它直接影响着显微镜的分辨率。而在普通光学显微镜中配置的几种物镱以油镱的放大倍数最大，与其它物镜相比，使用较特殊，需在载玻片与镜头之间加滴镜油，以增加照明亮度和提高分辨率。
三、材料与仪器
（1）材料 现成的标本玻片
（2）仪器 UB102i型生物显微镜（重庆奥浦光电技术有限公司），擦镜纸
四、操作步骤
（1）显微镜的安置
置显微镜于平整的实验台上，镜座距实验台边缘3～4cm，镱检时姿势要端正。
（2）调节光源
安装在镜座内的光源灯可通过调节电压以获得适当的照明亮度，而使用反光镱采集自然光或灯光作为照明光源时，应根据光源的强度及所用物镜的放大倍数选用凹面或平面反光镜度调节其角度，使视野内的光线均匀，亮度适宜。
（3）低倍镜观察
将标本玻片置于载物台上，用标本夹住，移动推进器使观察对象处在物镜的正下方，下降10×物镜，使其接过标本，用粗调节器（粗调螺旋）慢慢升起镜筒，出现图像后再用细调节器（细调螺旋）调节图像至清晰。通过标本夹推进器慢慢移动玻片，认真观察标本各部位，找到合适目的物，仔细观察。
（4）高倍镜观察
在低倍镜下找到合适的观察目标并将其移至视野中心后转动物镜转换器将高倍镜移至工作位置，以聚光镜器光圈及视野进行适当调节后微调细调节器使物象清晰，利用推进器移动标本仔细观察并记录。
（5）显微镜用后处理
1、上升镜筒，取下载片。
2、用擦镜纸擦去镜头上的残留物
3、用擦镜纸清洁其他物镜和目镜，用绸布清洁显微镜的金属部件。
4、将各部分还原，反光镜垂直于镜座，将物镜转成“八字形”再向下旋，同时把聚光镜降下，以免物镜与聚光镜发生碰撞危险。
五、实验结果
低倍镜下观察到的植物细胞组织
实验二 细菌培养基的配制
一、实验目的
1了解并掌握培养基的配制、分装方法；
2掌握各种实验室灭菌方法及技术。
二、实验原理
培养基是供微生物生长、繁殖、代谢的混合养料。由于微生物具有不同的营养类型，对营养物质的要求也各不相同，加之实验和研究的目的不同，所以培养基 的种类很多，使用的原料也各有差异，但从营养角度分析，培养基中一般含有微生物所必需的碳源、氮源、无机盐、生长素以及水分等。另外，培养基还应具有适宜 的pH值、一定的缓冲能力、一定的氧化还原电位及合适的渗透压。
琼脂是从石花菜等海藻中提取的胶体物质，是应用最广的凝固剂。加琼脂制成的培养基在98～100℃下融化，于45℃以下凝固。但多次反复融化，其凝固性降低。
任何一种培养基一经制成就应及时彻底灭菌，以备纯培养用。一般培养基的灭菌采用高压蒸汽灭菌。
三、实验材料
1、实验仪器
电子称、称量纸、量筒、锥形瓶8个、培养皿及培养皿盒44个、试管30根、玻璃棒、烧杯、剪刀、酒精灯、棉花、线绳、报纸、接种环。
B-260型恒温水浴锅 （上海亚荣生化器械厂）
YM型立式压力蒸汽灭菌锅（上海三申医疗器械有限公司）
UB102i型生物显微镜（重庆奥浦光电技术有限公司）
BSP-100生化培养箱（细菌用）（上海博讯实业有限公司）
2、药品
平板计数琼脂 (广东环凯生物科技有限公司）
营养琼脂
无水乙醇 (广东环凯生物科技有限公司） （华东医药有限公司）
（杭州微生物试剂有限公司） 营养肉汤培养基
四、实验步骤
1 培养基的制备
1.1 称量
称取已经配好的营养肉汤粉、蛋白胨、NaCl放入烧杯中。
1.2 溶化
在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量（沸水），用玻棒搅匀，然后，待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。因为是配制固体培养基，所以先将称好的琼脂放入已溶化的药品中，再加热溶化，在琼脂溶化的过程中，不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。
1.3 过滤分装
用滤纸、纱布或棉花趁热将已配好的培养基过滤。用纱布过滤时，最好折叠成六层，用滤纸过滤时，可将滤纸折叠成瓦棱形，铺在漏斗上过滤。
过滤完后的培养基进行分装。因为要制作平板培养基，则须将培养基分装于锥形瓶内。 分装时，一手捏松弹簧夹，使培养基流出，另一只手握住几支试管或锥形瓶，依次接取培养基。分装时，注意不要使培养基粘附管口或瓶口，以免浸湿棉塞引起杂菌污染。
装入试管的培养基量，视试管和锥形瓶的大小及需要而定。一般制作斜面培养基时，每只15×150毫米的试管，约装3～4毫升（1/4～1/3试管高度），如制作深层培养基，每只20×220毫米的试管约装12～15毫升。每只锥形瓶装入的培养基，一般以其容积的一半为宜。
1.4 包扎
分装完毕后，需要用棉塞堵住管口或瓶口。堵棉塞的主要目的是过滤空气，避免污染。棉塞应采用普通新鲜、干燥的棉花制作，不要用脱脂棉，以免因脱脂棉吸水使棉塞无法使用。制作棉塞时，要根据棉塞大小将棉花铺展成适当厚度，揪取手掌心大小一块，铺在左手拇指与食指圈成的圆孔中，用右手食指插入棉花中部，同时左手食指与姆指稍稍紧握，就会形成1个长棒形的棉塞。棉塞作成后，应迅速塞入管口或瓶口中，棉塞应紧贴内壁不留缝隙，以防空气中微生物沿皱折侵入。棉塞不要过紧过松，塞好后，以手提棉塞、管、瓶不下落为合适。棉塞的2/3应在管内或瓶内，上端露出少许棉花便于拔取。塞好棉塞的试管和锥形瓶应盖上厚纸用绳捆札，准备灭菌。试管十个一捆。
1.5湿热灭菌（采用高压蒸汽灭菌法）
将上述培养基以1210C,20min,0.103MPa高压蒸汽灭菌。
高压蒸汽灭菌用途广，效率高，是微生物学 实验中最常用的灭菌方法。这种灭菌方法是基于水的沸点随着蒸汽压力的升高而升高的原理设计的。当蒸汽压力达到1.05kg/cm2时，水蒸气的温度升高到 121℃，经15～30min，可全部杀死锅内物品上的各种微生物和它们的孢子或芽孢。一般培养基、玻璃器皿以及传染性标本和工作服等都可应用此法灭菌。
1.6 制作平板培养基
将刚刚灭过菌的盛有培养基的锥形瓶和培养皿放在实验台上，点燃酒精灯，右手托起锥形瓶瓶底，左手拔下棉塞，将瓶口在酒精灯上稍加灼烧，左手打开培养皿盖，右手迅速将培养基倒入培养皿中，每皿约倒入10毫升，以铺满皿底为度。铺放培养基后放置15分钟左右，待培养基凝固后，再5个培养皿一叠，倒置过来，平放在恒温箱里，理论上24小时后检查，如培养基末长杂菌，即可用来培养微生物。
实验三 细菌的简单染色和革兰氏染色
一、目的与要求
（1）掌握染色的原理和操作过程
（2）掌握简单染色和革兰氏染色法
（3）熟练显微镜的使用技术
二、原理
由于菌体极小，折光率低，在显微镜下不容易看清，如将其染色，使菌体和背景之间反差增大，折光率增强，就容易看清，简单染色法只用一种染料着色。革兰氏染色法是细菌染色中一种重要的鉴别染色法。通过此法染色，可将细菌鉴别为革兰氏阳性菌和阴性菌两大类。 其过程是：
草酸铵结晶紫初染→路哥尔氏碘液媒染→95%乙醇脱色→蕃红花红复染。
若细胞能保持结晶紫与碘所形成的复合物而不被乙醇脱色，则细菌呈紫色，称革兰氏阳性菌；
若被乙醇脱色而被蕃红复染成红色，则称革兰氏阴性菌。
三、实验仪器与药品
（1）实验仪器
载玻片、盖玻片、酒精灯、废液缸、洗瓶、接种环、显微镜、镊子
（2）实验药品
革兰氏染色液（草酸铵结晶紫液＋路哥尔氏碘液＋95%乙醇＋蕃红花红）、蒸馏水、菌落培养物（培养18～24小时）、二甲苯、香柏油
四、操作程序
（1）简单染色法
① 涂片 取洁净载玻片，在中央滴一滴生理盐水（或无菌水），用接种环以无菌操作挑取欲观察菌体，和水充分混匀，涂成极薄的菌膜。
② 干燥 室温自然干燥或略微加热干燥。
③ 固定 涂面朝上，快速通过火焰2—3次（勿使涂片烫手）。
④ 染色 滴染料，
⑤ 水洗 用自来水冲洗，直到涂片上流下的水无色为止。
⑥ 干燥 自然干燥或吸水纸吸干
（2）革兰氏染色法
涂片→干燥→固定→草酸铵结晶紫初染→水洗→碘液媒染→95%酒精脱色20~30秒→水洗→蕃红花红液复染→水洗干燥→镜检
1) 涂片：先滴一小滴蒸馏水于载玻片中央，然后用接种环取少量菌体轻轻混入水中，涂成一
薄层并使细胞均匀分散。
2) 干燥：在空气中令其自然干燥或在酒精灯火焰上端高处微微加温但勿靠近火焰。
3) 固定：把涂有细菌的面朝上，在酒精灯火焰上通过三次，目的是杀死菌体细胞以及改变对
染色剂的通透性，同时使涂片的菌体紧贴载玻片而不易被水冲洗脱落。
4) 初染：用草酸铵结晶紫液初染1min，水洗、吸干。
5) 媒染：加一滴路哥尔氏碘液媒染1min、水洗。（此时结晶紫与碘液成复合物）
6) 脱色：斜置载玻片，用95%酒精冲洗约20～30s，立即水洗，吸干。
7) 复染：用蕃红花红液复染1～2min，水洗晾干或用吸水纸吸干。
8) 镜检：在显微镜油浸镜下检查革兰氏阳性菌和阴性菌染色的差异，并观察菌体形态。
（三）革兰氏染色成败的控制点
① 涂片厚度：涂片过厚，细胞重叠，无法较好地观察单个细菌细胞形态，涂片过薄，细胞数量少，不利于观察；
② 染色时间。染色时间过长,结晶紫与细胞结合，脱色不易，染色不够，结晶紫尚未与细胞结合。染色控制不好，易引起误判；
③ 乙醇脱色的程度。如脱色过度，则阳性菌被误染为阴性菌；若脱色不够，则阴性菌被误染为阳性菌。
五、实验报告
1. （一）结果 说明3株细菌的染色观察结果（形态、颜色革兰氏染色结果）。膜染色的示
范片