摘 要:建立了一种同时测定人体胸腔积液中酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)的液相色谱分析方法,并将其应用于胸腔积液病因鉴别诊断。优化的液相色谱条件如下: Vertex TM AQ-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-10 mmol/L醋酸铵缓冲溶液(醋酸调至pH 5.6)为流动相进行梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长为210和278 nm。结果表明,3种氨基酸在各自相应的线性范围内线性相关系数均大于0.999; 信噪比为3时,检出限(LOD)分别为0.50, 0.17和0.20 μmol/L。胸腔积液样品经甲醇去除蛋白质后取上清液直接测定,3种氨基酸平均回收率在80.7%~101.1%之间,相对标准偏差为2.5%~8.7%。利用本方法对72例良恶性胸腔积液中的3种氨基酸进行分析,发现Tyr, Phe和Trp含量在不同疾病的样品中存在统计学差异,对胸腔积液病因鉴别诊断有一定的临床价值。 关键词:高效液相色谱; 氨基酸; 胸腔积液; 鉴别诊断 1 引 言 肺癌的发病率和死亡率在我国和全球都位列第一。目前肺癌的发现和诊断主要依靠影像学检查和组织病理活检,但存在一定漏诊和误诊,组织活检具有创伤性。原有的肺癌标志物如癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白片段19(CK19)、神经烯醇酶(NSE)、鳞状细胞癌相关抗原(SCC)等[1,2], 其特异及敏感性欠佳。因此开发新的、敏感性更高、特异性更强的潜在标志物对于肺癌的早期发现、病理分型、药物干预治疗等方面具有重要的指导意义。 芳香族氨基酸是指含有芳香环的氨基酸,如酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp),其代谢状态对人体具有重要的生理和病理意义。Neurauter等[3]利用高效液相色谱对卵巢癌患者的血浆进行分析,发现苯丙氨酸浓度显著高于正常人。Cascino等[4]研究发现血浆中游离氨基酸对不同肿瘤疾病具有不同的影响,肺癌患者较正常人的血浆中苏氨酸、丝氨酸和甘氨酸含量明显下降,色氨酸和谷氨酸明显升高,而乳腺癌患者中鸟氨酸、谷氨酸和色氨酸有明显增加。Deng等[5]应用HPLC/MS技术对胃恶性肿瘤病人和正常人胃液进行了对比分析,发现胃恶性肿瘤胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸含量明显高于正常人。研究表明,在恶性肿瘤患者和正常人血清、胃液等体液中,Tyr, Phe和Trp的芳香族氨基酸有明显区别,可以作为一种潜在的诊断标记物来筛选疾病。 目前,肺癌标记物主要研究对象集中在血清[6,7]、尿液[8,9]等体液以及各种组织[10,11]。胸腔积液是肺部疾病最为特异的人体体液,是肺癌或其他肺部疾病(如肺炎、结核性胸膜炎等)的常见并发症,是验证疾病病因、判断其良恶性的重要媒介之一[12]。目前对于良恶性胸腔积液的病因鉴别诊断研究主要集中在蛋白质组学[13,14],而对于其中氨基酸类的小分子代谢物研究未见报道。胸腔积液中含有大量亲水性物质,常规的反相和正相液相色谱未能将氨基酸和样品中复杂基质实现有效分离,而利用亲水作用机理来分析生物样品得到极大关注。本研究建立了基于极性基团改性的C18柱的HPLC方法,对恶性胸腔积液(肺癌患者产生)和良性胸腔积液(肺部感染疾病产生)中Tyr、Phe和Trp进行检测,并应用统计学方法探讨其对肺癌辅助诊断及确定临床病理分型的意义。 3 结果与讨论 3.1 蛋白沉淀剂的选择 在实验中,采用甲醇和乙腈两种常用的有机蛋白沉淀剂做了对比分析。对于同一份胸腔积液样分别用这两种溶剂进行沉淀蛋白,其余处理方法都相同。结果表明,经过高效液相色谱分析,甲醇除蛋白后得到的色谱图上具有更多的峰和更高的峰强度。 3.2 色谱条件的优化 对3种目标化合物Tyr、Phe和Trp进行全波长扫描,最大吸收波长分别为275, 210和278 nm,故采用278 nm对Tyr和Trp定量分析,采用210 nm对Phe定量分析。通过比较流动相中缓冲溶液的不同浓度(5, 10, 20和50 mmol/L)以及不同pH 值(4.6, 5.6, 6.6和7.6),确定乙腈-10 mmol/L醋酸铵缓冲溶液(pH 5.6)作为流动相。梯度洗脱程序如2.2节所述,一个样品的分析在40 min内可完成。 比较了Waters sunfire C18柱和Vertex TM AQ-C18柱对样品中Tyr、Phe和Trp的分离效果,AQ-C18柱的流动相为上述优化条件,而Waters sunfire C18柱的流动相条件如下: 流动相A为甲醇,流动相B为10 mmol/L醋酸铵缓冲溶液; 梯度洗脱程序: 0~5 min,10% A; 5~20 min,10%~30% A; 20~35 min,30%~60% A; 35~36 min,60%~10% A; 36~40 min,10% A。图1中a和b分别是采用Waters sunfire C18柱在210和278 nm检测波长下分离得到的色谱图; c和d分别是采用Vertex TM AQ-C18柱在210和278 nm检测波长下分离得到的色谱图。由图1可见,使用Waters sunfire C18柱时,酪氨酸不能得到有效分离,而AQ-C18色谱柱能使样品中3种氨基酸均得到有效分离。这是因为使用Waters sunfire C18柱时,流动相中水的比例一般不能超过90%,这不利于酪氨酸与胸腔积液中大量亲水性物质的分离。而AQ-C18色谱柱是一种极性基团改性的C18柱,能与100%的水流动相兼容,对于亲水性与极性化合物具有更强的保留能力和选择性,因而使样品中3种氨基酸既可有效分离,又各有合适的保留时间,且未受到其它色谱峰的干扰。因此,本实验采用Vertex TM AQ-C18色谱柱分析胸腔积液中的3种氨基酸。 3.4 良恶性胸腔积液中Tyr、Phe和Trp含量差别 采用本方法对72例肺癌和肺部良性疾病患者胸腔积液进行了分析(图2)。图2中a~f分别为210和278 nm检测波长下得到的3种氨基酸标准溶液、恶性及良性胸腔积液的色谱图。图中1、2和3所指色谱峰分别为酪氨酸,苯丙氨酸和色氨酸,其保留时间分别为6.24, 9.23和12.09 min,3种芳香族氨基酸均得到了有效分离。根据外标法计算得到沉淀蛋白后每个样品中3种物质的含量(原实际样品含量为该值的4倍,浓度分布范围见表4),分别对肺癌组与肺部感染疾病组,肺癌组与结核性胸膜炎组,肺癌组与肺炎组以及结核性胸膜炎与肺炎组3种氨基酸含量采用独立样本t检验进行统计学分析,结果见表4。
摘 要:建立了一种同时测定人体胸腔积液中酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp)的液相色谱分析方法,并将其应用于胸腔积液病因鉴别诊断。优化的液相色谱条件如下: Vertex TM AQ-C18色谱柱(250 mm×4.6 mm,5 μm),以乙腈-10 mmol/L醋酸铵缓冲溶液(醋酸调至pH 5.6)为流动相进行梯度洗脱,流速1.0 mL/min,检测波长为210和278 nm。结果表明,3种氨基酸在各自相应的线性范围内线性相关系数均大于0.999; 信噪比为3时,检出限(LOD)分别为0.50, 0.17和0.20 μmol/L。胸腔积液样品经甲醇去除蛋白质后取上清液直接测定,3种氨基酸平均回收率在80.7%~101.1%之间,相对标准偏差为2.5%~8.7%。利用本方法对72例良恶性胸腔积液中的3种氨基酸进行分析,发现Tyr, Phe和Trp含量在不同疾病的样品中存在统计学差异,对胸腔积液病因鉴别诊断有一定的临床价值。 关键词:高效液相色谱; 氨基酸; 胸腔积液; 鉴别诊断 1 引 言 肺癌的发病率和死亡率在我国和全球都位列第一。目前肺癌的发现和诊断主要依靠影像学检查和组织病理活检,但存在一定漏诊和误诊,组织活检具有创伤性。原有的肺癌标志物如癌胚抗原(CEA)、细胞角蛋白片段19(CK19)、神经烯醇酶(NSE)、鳞状细胞癌相关抗原(SCC)等[1,2], 其特异及敏感性欠佳。因此开发新的、敏感性更高、特异性更强的潜在标志物对于肺癌的早期发现、病理分型、药物干预治疗等方面具有重要的指导意义。 芳香族氨基酸是指含有芳香环的氨基酸,如酪氨酸(Tyr)、苯丙氨酸(Phe)和色氨酸(Trp),其代谢状态对人体具有重要的生理和病理意义。Neurauter等[3]利用高效液相色谱对卵巢癌患者的血浆进行分析,发现苯丙氨酸浓度显著高于正常人。Cascino等[4]研究发现血浆中游离氨基酸对不同肿瘤疾病具有不同的影响,肺癌患者较正常人的血浆中苏氨酸、丝氨酸和甘氨酸含量明显下降,色氨酸和谷氨酸明显升高,而乳腺癌患者中鸟氨酸、谷氨酸和色氨酸有明显增加。Deng等[5]应用HPLC/MS技术对胃恶性肿瘤病人和正常人胃液进行了对比分析,发现胃恶性肿瘤胃液中酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸含量明显高于正常人。研究表明,在恶性肿瘤患者和正常人血清、胃液等体液中,Tyr, Phe和Trp的芳香族氨基酸有明显区别,可以作为一种潜在的诊断标记物来筛选疾病。 目前,肺癌标记物主要研究对象集中在血清[6,7]、尿液[8,9]等体液以及各种组织[10,11]。胸腔积液是肺部疾病最为特异的人体体液,是肺癌或其他肺部疾病(如肺炎、结核性胸膜炎等)的常见并发症,是验证疾病病因、判断其良恶性的重要媒介之一[12]。目前对于良恶性胸腔积液的病因鉴别诊断研究主要集中在蛋白质组学[13,14],而对于其中氨基酸类的小分子代谢物研究未见报道。胸腔积液中含有大量亲水性物质,常规的反相和正相液相色谱未能将氨基酸和样品中复杂基质实现有效分离,而利用亲水作用机理来分析生物样品得到极大关注。本研究建立了基于极性基团改性的C18柱的HPLC方法,对恶性胸腔积液(肺癌患者产生)和良性胸腔积液(肺部感染疾病产生)中Tyr、Phe和Trp进行检测,并应用统计学方法探讨其对肺癌辅助诊断及确定临床病理分型的意义。 3 结果与讨论 3.1 蛋白沉淀剂的选择 在实验中,采用甲醇和乙腈两种常用的有机蛋白沉淀剂做了对比分析。对于同一份胸腔积液样分别用这两种溶剂进行沉淀蛋白,其余处理方法都相同。结果表明,经过高效液相色谱分析,甲醇除蛋白后得到的色谱图上具有更多的峰和更高的峰强度。 3.2 色谱条件的优化 对3种目标化合物Tyr、Phe和Trp进行全波长扫描,最大吸收波长分别为275, 210和278 nm,故采用278 nm对Tyr和Trp定量分析,采用210 nm对Phe定量分析。通过比较流动相中缓冲溶液的不同浓度(5, 10, 20和50 mmol/L)以及不同pH 值(4.6, 5.6, 6.6和7.6),确定乙腈-10 mmol/L醋酸铵缓冲溶液(pH 5.6)作为流动相。梯度洗脱程序如2.2节所述,一个样品的分析在40 min内可完成。 比较了Waters sunfire C18柱和Vertex TM AQ-C18柱对样品中Tyr、Phe和Trp的分离效果,AQ-C18柱的流动相为上述优化条件,而Waters sunfire C18柱的流动相条件如下: 流动相A为甲醇,流动相B为10 mmol/L醋酸铵缓冲溶液; 梯度洗脱程序: 0~5 min,10% A; 5~20 min,10%~30% A; 20~35 min,30%~60% A; 35~36 min,60%~10% A; 36~40 min,10% A。图1中a和b分别是采用Waters sunfire C18柱在210和278 nm检测波长下分离得到的色谱图; c和d分别是采用Vertex TM AQ-C18柱在210和278 nm检测波长下分离得到的色谱图。由图1可见,使用Waters sunfire C18柱时,酪氨酸不能得到有效分离,而AQ-C18色谱柱能使样品中3种氨基酸均得到有效分离。这是因为使用Waters sunfire C18柱时,流动相中水的比例一般不能超过90%,这不利于酪氨酸与胸腔积液中大量亲水性物质的分离。而AQ-C18色谱柱是一种极性基团改性的C18柱,能与100%的水流动相兼容,对于亲水性与极性化合物具有更强的保留能力和选择性,因而使样品中3种氨基酸既可有效分离,又各有合适的保留时间,且未受到其它色谱峰的干扰。因此,本实验采用Vertex TM AQ-C18色谱柱分析胸腔积液中的3种氨基酸。 3.4 良恶性胸腔积液中Tyr、Phe和Trp含量差别 采用本方法对72例肺癌和肺部良性疾病患者胸腔积液进行了分析(图2)。图2中a~f分别为210和278 nm检测波长下得到的3种氨基酸标准溶液、恶性及良性胸腔积液的色谱图。图中1、2和3所指色谱峰分别为酪氨酸,苯丙氨酸和色氨酸,其保留时间分别为6.24, 9.23和12.09 min,3种芳香族氨基酸均得到了有效分离。根据外标法计算得到沉淀蛋白后每个样品中3种物质的含量(原实际样品含量为该值的4倍,浓度分布范围见表4),分别对肺癌组与肺部感染疾病组,肺癌组与结核性胸膜炎组,肺癌组与肺炎组以及结核性胸膜炎与肺炎组3种氨基酸含量采用独立样本t检验进行统计学分析,结果见表4。