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中国抗生素杂志2003年1月第28卷第1期
文章编号:1001-8689(2003) 01-0060-05
B -内酰胺酶抑制剂克拉维酸研究进展
Advances in B -lactamase inhibitor clavulanic acid
孟勇1, 2 张国华1 王忠彦2 官家发1*
M eng Yong 1, 2, Zhang Guo -hua 1, Wang Zhong -yan 2 and Guan Jia -fa 1
(1中国科学院成都生物研究所, 成都610041;
2四川大学生命科学学院, 成都610064)
(1Chengdu I nstitute of Biolog y, Academia Sinica, Chengdu 610041;
2Colleg e of L ife Science, Sichuan U niv ersity, Chengdu 610064)
-内酰胺酶抑制剂克拉维酸(clavulanic acid, CA ) 产生菌的种类、作用机理、生 摘要: 综述了临床使用的B
物合成、代谢调控、以及提高克拉维酸产量的策略等方面的最新研究进展。
关键词: 克拉维酸; 产生菌种; 作用机理; 生物合成; 代谢调控中图分类号:R978. 1+9 文献标识码:A
由于青霉素的广泛使用, 某些细菌尤其是金黄色葡萄球菌对它产生了耐药性。青霉素类和头孢菌素类药物均含有一个共同的B -内酰胺结构, 属B -内酰胺类
抗生素。当使用具有这种结构的抗生素时, 部分病原菌通过产生B -内酰胺酶这一机制而产生耐药性。研究和临床应用结果表明, 克拉维酸、舒巴坦等B -内酰胺酶抑制剂, 可大大提高上述病原菌对B -内酰胺类抗生素的敏感性。
克拉维酸(clavulanic acid, CA) 分子为一个稠合双环B -内酰胺结构(Fig. 1) , 它以氧原子取代了青霉素及头孢菌素噻唑环中的硫原子, 具有作为B -内酰胺酶抑制剂所必须的3R, 5R 立体化学结构[1, 2]。
克拉维酸本身的抗菌活性很弱, 但它是强力、广谱且不可逆的B -内酰胺酶抑制剂。不论在体外或体内都能同耐药的革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌, 特别是同金黄色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌和奇异变形菌所产
生的B -内酰胺酶生成牢固不可逆的结合物, 从而抑制耐药性细菌对B -内酰胺类抗生素的分解作用, 恢复青霉素类及头孢菌素类抗生素对许多产生B -内酰胺酶的耐药菌的抗菌活性。
本文综述了克拉维酸产生菌的种类、作用机理、生物合成、代谢调控以及提高克拉维酸产量的策略等方面的最新研究进展。1 克拉维酸产生菌
1971年Lilly 研究所的H iggens 和Kastnerh 从南美土壤中分离到一株头孢霉素C 产生菌带棒链霉菌(S. clav uliger us ) [3], 在其代谢产物中还发现有其它B -内酰胺类抗生素如异青霉素N(isopenicillin N) 和去乙酰头孢菌素C (deacetylcephalosporin C ) 。S. clavuligerus 的不同菌株还能产生非B -内酰胺类抗生素如全霉素(holomy cin) , 衣霉素(tunicamycin ) 等。1976年英国Beecham 公司Bromn 等首次从带棒链霉菌(S. clavuliger us ATCC27064) 的发酵液中发现了天然的B -内酰胺酶抑制剂CA [1], 后来发现该菌株还产生B -内酰胺酶抑制蛋白(B -lactamase -inhibitory pro -tein, BLIP) , 目前对BLIP 结构、功能、基因克隆、代谢调控的研究已有了新的进展[4]。最近研究发现带棒
Fig. 1 T he structure of clavulanic aid
链霉菌还能合成增效磺胺(cefm inox) 。除带棒链霉菌
收稿日期:2002-08-26
基金项目:四川省科技厅重点科技项目(02SG011-050) , 珠海联邦制药有限公司资助。
*
通讯联系人:T el(028) 85236462, Fax(028) 85222753 E -mail:guanjfoo@sohu. com
:, 年,
B -内酰胺酶抑制剂克拉维酸研究进展 孟勇等
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均可掺入到CA(碳5, 6, 7) , 但乳酸或甘油酸二位碳上的氢却不能掺入, 说明这两种物质在掺入前均需被转变成丙酮酸盐。最近, 催化连接精氨酸和三碳单元
的酶(CEA 合成酶) 已得到纯化, 此酶以D -3-磷酸甘油醛为底物。因此, 尽管其它三碳物质可能最终有不同的利用效率, 但显然D -3-磷酸甘油醛是CA 分子中三碳单元的直接前体。
3. 2 克拉维酸生物合成途径
通过同位素标记、中间代谢物的分离、酶的纯化及其特性和基因的研究, CA 生物合成途径如今已部分阐明(Fig. 3) [10]。研究中首先分离到的代谢中间物是克拉维胺酸(clavaminic acid) 和前克拉维胺酸(pro -clavaminic acid) , 后来又分离到两种胍基化合物N 2-2-羧乙基-精氨酸(N 2-2-carbox yethy-l arginine, CEA) 和脱氧胍基前克拉维胺酸(deoxyguanidinoproclavam inic acid, DGPC) 。
CEA 合成酶(CEA synthetase) 由位于CA 基因簇中的p yc (pyruvate -converting) 基因编码, 含582个氨基酸, 具有识别丙酮酸盐及硫氨素焦磷酸(T PP) 的结构域[11]。在AT P 、Mg 2+存在下, CEA 合成酶以类似于肽键合成酶的方式催化D -3-磷酸甘油醛同精氨酸以C-N 键连接形成CEA, 但其辅因子TPP 的功能却不同于常用于辅助催化形成C -C 键的T PP 的功能。因为丙酮酸盐并不是CEA 合成酶的真正底物, 故p yc 基因应当重新命名为ceaS 。
CA 基因簇中, ORF3的破坏将导致S. clavuli -gerus bls 突变株积累大量的CEA, 但通过化学添加DGPC, 可使突变株恢复CA 生产能力。催化CEA 转变为DGPC 的酶被命名为B -内酰胺合成酶[12](B -lac -[2]
(S. clav uliger us ) 作为CA 产生菌外, S. j umonj inensis 及S. katsuraham anus 也曾被用作CA 的产生菌。新近有报道在重庆地区筛选到一株CA 产生菌带棒链霉
菌亚种(S. clavuligerus sub. sp. 3. 048) [5]。2 克拉维酸作用机理
CA 同B -内酰胺酶的活性位点有很高亲和力, 能与B -内酰胺酶的催化中心相结合, 以竞争性抑制剂方式发挥作用。它通过其B -内酰胺羰基与酶分子中的丝氨酸羟基发生反应打开B -内酰胺环而使酶酰化(Fig. 2) 。该反应类似于B -内酰胺酶同敏感底物如青霉素之间的反应。对于B -内酰胺类抗生素底物, 酰基-酶复合物迅速水解, 释放出酶和无抗菌活性的产物; 而由CA 与酶形成的酰基-酶复合物则相对比较稳定, 水解很慢, 或者因为B -内酰胺环的水解及随后口恶唑烷环的打开使暴露出的反应基团同酶发生进一步反应而使复合物更加稳定。产生这种类型抑制作用的化合物被称为自杀性抑制剂或依赖失活作用机理的灭活剂。由于这些反应具有时间依赖性, 因此CA 可称是一个进行性抑制剂[6]
。
Fig. 2 T he interaction between CA and B -lactamase
tam synthetase, bls) 。在AT P 、M g 2+存在下, 它催化CEA 在分子内形成酰胺键, 产生DGPC 。利用DGPC 作底物, 克拉维胺合成酶(clavam inate synthase, CAS)
可将其转变为克拉维胺酸[13]。纯化后的CAS, 其活性与4516ku 和4616ku 的两条多肽相关, 即CAS1, CAS2。它们均为非血红素铁双加氧酶, 以DGPC 和A -酮戊二酸作为底物, 将氧分子中的一个氧原子以羟基的形式引入DGPC, 形成胍基前克拉维胺酸。尔后通过两步氧化即环化和去饱和(脱氢) 使前克拉维胺酸转变为克拉维胺酸。因CAS2不能以胍基前克拉胺酸作为环化底物, 故在CAS2催化环化及去饱和反应之前, 胍基前克拉维胺酸上的胍基必须先被除去。一个3118ku 的辅助催化蛋白在纯化ACV(三肽, 头孢霉素C 合成前体) 合成酶时被偶然分离到[14]。利用此蛋白的N 端设p 3 克拉维酸生物合成机制3. 1 克拉维酸生物合成前体
1978年Elson 等
[7]
进行标记前体化合物掺入CA
的研究。结果表明, 酯酸盐可形成CA 分子的一部分五碳骨架(碳2, 3, 及8, 9, 10) ; 甘油可提供B -内酰胺环(碳5, 6, 7) 的碳骨架
[3]
。随后研究发现, 鸟氨酸与精
氨酸均可有效掺入CA(碳2, 3, 8, 9, 10) 。但因鸟氨酸为精氨酸合成代谢中的一个中间产物, 故精氨酸的掺入并不能排除鸟氨酸作为CA 合成的直接前体[8]。Valentine 等
[9]
利用不能将鸟氨酸转变为精氨酸的
argF , argG 突变株进行研究发现, 精氨酸为CA 的直
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Fig. 3 T he pathway and gene cluster of CA biosynthesi s
Glyceraldehyde -3-p 为3磷酸甘油醛; Arginine 为精氨酸; N2-2-carboxyethy -l arginine(CEA)为N 2-2-羧乙基-精氨酸; deoxyguani dioprocl avami nic acid(DGPC)为脱氧胍基前克拉维胺酸; dihydrocl avami nic aci d 为二氢前克拉维胺酸;
proc lavaminic acid 为前克拉维胺酸; clavamini c acid 为克拉维胺酸; clavaldehyde 为克拉维醛; clavulani c acid 为CA; ceaS 为CEA 合成酶; B -LS 为B -内酰胺合成酶; CAS 为克拉维胺酸合成酶; CAS2为克拉维胺酸合成酶同功酶Ò; PAH 为胍基前克拉维胺酸脒基水解酶; CAR 为依赖NADP 克拉维醛还原酶。
2+
与脒基转移酶非常相似, 催化需要M n 的存在。通过
麦芽糖结合蛋白与PAH (proclavaminic am inidino hydrolase, 前克拉维胺氨基水解酶) 融合进行表达, 在除去融合伙伴(麦芽糖结合蛋白) 后得到的多肽具有PAH 活性, 催化胍基前克拉维胺酸转变为前克拉维胺酸。此反应的Km 值为CAS2的Km 值的50~100倍, 由此知, 它很可能是CA 合成的限制性步骤。
CA 碳9位上的氧来自于标记的O 2表明, 克拉维胺酸碳9位上的氨基被氧化脱氨后形成CA 碳9位上的醛基(即克拉维醛) 。这种化合物已在S clav uliger ns dcl -8(CA 合成缺陷型) 突变株中被检测到。克拉维醛因具有相应的3R, 5R 立体化学结构而有B -内酰胺酶抑制活性, 但与CA 比较不够稳定。目前催化形成克拉维醛的酶尚未得到分离, CA 基因簇中亦未发现具有编码氨基转移酶的基因。
催化克拉维醛转变为CA 的酶是依赖NADP 的克拉维醛还原酶[15](clavaldehyde reductase, CAR) , 此酶N 于cas 2基因下游4kb 处的car 基因编码。更多的有关CA 生物合成的基因可能位于car 基因上游。ORF10即为其中之一, 它编码类细胞色素P450蛋白, 对CA 的生物合成是不可或缺的。4 克拉维酸合成的基因调控
2000年Liras 等对克拉维酸合成的基因调控进行了较为全面的论述[10]。
在链霉菌中, 抗生素合成和孢子形成是由一系列调控基因控制的。丁酰内酯家族内的一些可扩散因子就位于这个等级调控的最顶端。这些分子通过级联调控方式发挥作用, 在调控的最底端就是代谢途径专一性的转录调控因子, 它们可在所有的抗生素产生基因簇中发现。
一个能够加速抗生素生物合成的热稳定因子已从S. clavuliger us 孢子中分离得到, 这个由CA 基因簇ORF7编码的产物同寡肽渗透酶十分相似, 但是否与CA 合成开始的肽转移有关仍需进一步证实。
B -内酰胺酶抑制剂克拉维酸研究进展 孟勇等
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及CA 产量均得到了提高。此现象可通过以下方式解释:我们可以认为CA 合成是精氨酸的一种代谢调控方式, 因为其它生物体中的ArgR 可刺激精氨酸代谢
(抑制精氨酸合成) , 故ArgR 可促进精氨酸在S. clavu -liger us 中向CA 转化。5 提高克拉维酸产量的策略
提高CA 产量是CA 研究的热点课题。在不十分清楚CA 生物合成及调控机制的情况下, 笔者认为利用经典遗传学技术改良菌种为行之有效的提高CA 产量的方略。Choi 等经紫外线和NTG 诱变, 筛选出产量提高10倍的菌株, 又将上述诱变过程得到的Arg 营养缺陷型菌株和Cys 缺陷型菌株进行原生质体融合获得比原始出发菌株CA 产量高出30倍的高产菌株CKD1386。必须指出菌种改良的关键技术在于理性化筛选方法。发酵条件的优化亦是不可或缺的工作。2001年中国药科大学陈向东等[18]采用关联度分析法对CA 发酵培养基组成进行优化, 结果使产酸水平提高1718%。2001年Gouveia 等报道他们对培养基进行优化后, CA 产量可达112g /L 。笔者实验室正从事CA 产生菌(Str ep tomyces clavuliger us ) ATCC27064的改良和发酵条件优化研究, 通过理性化筛选获得的突变株CA 产量可达到018~110g /L, 同时发现甘油、大豆蛋白胨等因素对CA 产量有显著的影响, 深入的研究工作正在进行之中。
随着有关CA 分子生物学知识的积累, 通过基因工程手段改造CA 产生菌将成为可能。因CA 的生物合成受到级联调控, 故某些调控基因(如ccaR 、claR 、bldA 等基因) 的变化可能会使CA 产量获得提高; 另外, 也可通过增加正调控因子或限制步骤酶的拷贝数来增加CA 的产量, 如增加前文所述的ccaR 、claR 、argR 、p ah 等基因的拷贝数。当然亦有人提出:可尝试把整个CA 生物合成基因簇导入到一个异源寄主中, 这样也许会解除CA 生物合所受到的调节使CA 产量增加[20]。
6 结束语
几十年来, 由于抗生素的大量使用, 导致了细菌对很多药物的抗药性, 这已成为临床上治疗细菌性疾病的一个棘手问题。CA, 作为B -内酰胺酶抑制剂, 同B -内酰胺类抗生素联合使用对于杀灭产生B -内酰胺酶的耐药菌有良好的作用。但CA 的抗耐药性功能仅限于产生B -内酰胺酶的耐药菌。且如其它抗生素一样, 随着克拉维酸青霉素复合制剂的应用, 抗性菌株亦开始出现于临床。目前, 人类面临的是如何迎接广泛存在[19]
[17]
4kb 处, 编码由256个氨基酸组成的类ActII -ORF -4调控蛋白, 同通用的调控蛋白(AfsR) 和抗生素专一性调控蛋白(DnrI. RedD. ActII -ORF -4) 具有26%~29%的相同序列。CcaR 属于SARP 类蛋白(Streptomyces antibiotic regulatory protein) , 象OmpR 家族类调控蛋白DNA 结合域的三维结构一样, SARP 蛋白在DNA 结合结构域相应螺旋上也包含大量保守氨基酸。ccaR 的突变将导致头孢霉素C 、CA 或其它克拉维胺合成的停止。尽管头孢霉素C 和CA 这两个B -内酰胺类物质是由完全不同的途经合成的, 但扩增ccaR , 将使头孢霉素C 和CA 产量成倍的增加。
链霉菌中T TA 密码子涉及到由bldA 编码的稀有亮氨酰t -RNA 介导的翻译调控[16]。在S. coelicolor 中, ActII -ORF -4编码的调控蛋白的表达水平受到一个由TTA 密码子调控的基因的调控。与之类似, 编码CcaR 蛋白的32位的亮氨酸密码子, 同样受到bldA 的调控。
claR , 一个B -内酰胺调控基因, 位于CA 基因簇下游3kb 处, 方向与cas2相反。它编码一个4616ku 的多肽, 同许多LysR 家族的转录调控因子具有同源性。其N 端、C 端有两个特征性的DNA 结合域, 螺旋一转角一螺旋基元。claR 基因的扩增将导致CA 和丙酰克拉维胺产量的增加且可极大的减少头孢霉素C 的产生。
ClaR 是一个117kb 的单顺反子的表达产物, 它并不受自身蛋白的调控。其转录产物和car 基因转录产物在ccaR 基因破坏的突变株中均不可见, 而claR 的失活将使car 、克拉维酸基因簇中的ORF9、ORF10的转录物不表达, 并且产生头孢霉素C 合成增加, CA 合成缺失的突变, 但这种突变可积累克拉维胺酸。这表明claR 控制涉及到CA 合成后面步骤的基因, 且ccaR 和claR 的级联调控同时控制着头孢霉素C 和CA 的合成。
目前在lat 基因(头孢霉素合成的第一个基因, 因此也是进行调控的首选基因) 启动子上尚未发现CcaR 结合区。lat 启动子下的报道基因也不受CcaR 的影响, 这表明, 有其它的因子参与了CcaR 和ClaR 之间的级联调控。当然, lat 启动子也可能并不是CcaR 调控的靶点, 基因簇中其它生物合成基因的启动子被用作转录调控靶点的研究正在进行之中。
另外, 通过前体物的可获得性亦可对CA 合成进行间接调控。精氨酸合成基因及抑制精氨酸合成的调控蛋白(ArgR) 已得到了研究。在S. clavuliger us 中
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决耐药性问题的根本途径可能应从耐药性产生的遗传学及生物化学机理中寻找突破口, 利用新的思路去发掘新的抗生素以及细菌细胞中存在的抗生素作用的新靶点, 如包括笔者实验室在内的国内外几家实验室正在进行的以细菌蛋白质分泌功能为靶点的抗耐药性化合物的研究, 很有可能成为解决耐药性问题的有效途径之一
[21]
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Fig. 1 T he structure of clavulanic aid
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的酶(CEA 合成酶) 已得到纯化, 此酶以D -3-磷酸甘油醛为底物。因此, 尽管其它三碳物质可能最终有不同的利用效率, 但显然D -3-磷酸甘油醛是CA 分子中三碳单元的直接前体。
3. 2 克拉维酸生物合成途径
通过同位素标记、中间代谢物的分离、酶的纯化及其特性和基因的研究, CA 生物合成途径如今已部分阐明(Fig. 3) [10]。研究中首先分离到的代谢中间物是克拉维胺酸(clavaminic acid) 和前克拉维胺酸(pro -clavaminic acid) , 后来又分离到两种胍基化合物N 2-2-羧乙基-精氨酸(N 2-2-carbox yethy-l arginine, CEA) 和脱氧胍基前克拉维胺酸(deoxyguanidinoproclavam inic acid, DGPC) 。
CEA 合成酶(CEA synthetase) 由位于CA 基因簇中的p yc (pyruvate -converting) 基因编码, 含582个氨基酸, 具有识别丙酮酸盐及硫氨素焦磷酸(T PP) 的结构域[11]。在AT P 、Mg 2+存在下, CEA 合成酶以类似于肽键合成酶的方式催化D -3-磷酸甘油醛同精氨酸以C-N 键连接形成CEA, 但其辅因子TPP 的功能却不同于常用于辅助催化形成C -C 键的T PP 的功能。因为丙酮酸盐并不是CEA 合成酶的真正底物, 故p yc 基因应当重新命名为ceaS 。
CA 基因簇中, ORF3的破坏将导致S. clavuli -gerus bls 突变株积累大量的CEA, 但通过化学添加DGPC, 可使突变株恢复CA 生产能力。催化CEA 转变为DGPC 的酶被命名为B -内酰胺合成酶[12](B -lac -[2]
(S. clav uliger us ) 作为CA 产生菌外, S. j umonj inensis 及S. katsuraham anus 也曾被用作CA 的产生菌。新近有报道在重庆地区筛选到一株CA 产生菌带棒链霉
菌亚种(S. clavuligerus sub. sp. 3. 048) [5]。2 克拉维酸作用机理
CA 同B -内酰胺酶的活性位点有很高亲和力, 能与B -内酰胺酶的催化中心相结合, 以竞争性抑制剂方式发挥作用。它通过其B -内酰胺羰基与酶分子中的丝氨酸羟基发生反应打开B -内酰胺环而使酶酰化(Fig. 2) 。该反应类似于B -内酰胺酶同敏感底物如青霉素之间的反应。对于B -内酰胺类抗生素底物, 酰基-酶复合物迅速水解, 释放出酶和无抗菌活性的产物; 而由CA 与酶形成的酰基-酶复合物则相对比较稳定, 水解很慢, 或者因为B -内酰胺环的水解及随后口恶唑烷环的打开使暴露出的反应基团同酶发生进一步反应而使复合物更加稳定。产生这种类型抑制作用的化合物被称为自杀性抑制剂或依赖失活作用机理的灭活剂。由于这些反应具有时间依赖性, 因此CA 可称是一个进行性抑制剂[6]
。
Fig. 2 T he interaction between CA and B -lactamase
tam synthetase, bls) 。在AT P 、M g 2+存在下, 它催化CEA 在分子内形成酰胺键, 产生DGPC 。利用DGPC 作底物, 克拉维胺合成酶(clavam inate synthase, CAS)
可将其转变为克拉维胺酸[13]。纯化后的CAS, 其活性与4516ku 和4616ku 的两条多肽相关, 即CAS1, CAS2。它们均为非血红素铁双加氧酶, 以DGPC 和A -酮戊二酸作为底物, 将氧分子中的一个氧原子以羟基的形式引入DGPC, 形成胍基前克拉维胺酸。尔后通过两步氧化即环化和去饱和(脱氢) 使前克拉维胺酸转变为克拉维胺酸。因CAS2不能以胍基前克拉胺酸作为环化底物, 故在CAS2催化环化及去饱和反应之前, 胍基前克拉维胺酸上的胍基必须先被除去。一个3118ku 的辅助催化蛋白在纯化ACV(三肽, 头孢霉素C 合成前体) 合成酶时被偶然分离到[14]。利用此蛋白的N 端设p 3 克拉维酸生物合成机制3. 1 克拉维酸生物合成前体
1978年Elson 等
[7]
进行标记前体化合物掺入CA
的研究。结果表明, 酯酸盐可形成CA 分子的一部分五碳骨架(碳2, 3, 及8, 9, 10) ; 甘油可提供B -内酰胺环(碳5, 6, 7) 的碳骨架
[3]
。随后研究发现, 鸟氨酸与精
氨酸均可有效掺入CA(碳2, 3, 8, 9, 10) 。但因鸟氨酸为精氨酸合成代谢中的一个中间产物, 故精氨酸的掺入并不能排除鸟氨酸作为CA 合成的直接前体[8]。Valentine 等
[9]
利用不能将鸟氨酸转变为精氨酸的
argF , argG 突变株进行研究发现, 精氨酸为CA 的直
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Fig. 3 T he pathway and gene cluster of CA biosynthesi s
Glyceraldehyde -3-p 为3磷酸甘油醛; Arginine 为精氨酸; N2-2-carboxyethy -l arginine(CEA)为N 2-2-羧乙基-精氨酸; deoxyguani dioprocl avami nic acid(DGPC)为脱氧胍基前克拉维胺酸; dihydrocl avami nic aci d 为二氢前克拉维胺酸;
proc lavaminic acid 为前克拉维胺酸; clavamini c acid 为克拉维胺酸; clavaldehyde 为克拉维醛; clavulani c acid 为CA; ceaS 为CEA 合成酶; B -LS 为B -内酰胺合成酶; CAS 为克拉维胺酸合成酶; CAS2为克拉维胺酸合成酶同功酶Ò; PAH 为胍基前克拉维胺酸脒基水解酶; CAR 为依赖NADP 克拉维醛还原酶。
2+
与脒基转移酶非常相似, 催化需要M n 的存在。通过
麦芽糖结合蛋白与PAH (proclavaminic am inidino hydrolase, 前克拉维胺氨基水解酶) 融合进行表达, 在除去融合伙伴(麦芽糖结合蛋白) 后得到的多肽具有PAH 活性, 催化胍基前克拉维胺酸转变为前克拉维胺酸。此反应的Km 值为CAS2的Km 值的50~100倍, 由此知, 它很可能是CA 合成的限制性步骤。
CA 碳9位上的氧来自于标记的O 2表明, 克拉维胺酸碳9位上的氨基被氧化脱氨后形成CA 碳9位上的醛基(即克拉维醛) 。这种化合物已在S clav uliger ns dcl -8(CA 合成缺陷型) 突变株中被检测到。克拉维醛因具有相应的3R, 5R 立体化学结构而有B -内酰胺酶抑制活性, 但与CA 比较不够稳定。目前催化形成克拉维醛的酶尚未得到分离, CA 基因簇中亦未发现具有编码氨基转移酶的基因。
催化克拉维醛转变为CA 的酶是依赖NADP 的克拉维醛还原酶[15](clavaldehyde reductase, CAR) , 此酶N 于cas 2基因下游4kb 处的car 基因编码。更多的有关CA 生物合成的基因可能位于car 基因上游。ORF10即为其中之一, 它编码类细胞色素P450蛋白, 对CA 的生物合成是不可或缺的。4 克拉维酸合成的基因调控
2000年Liras 等对克拉维酸合成的基因调控进行了较为全面的论述[10]。
在链霉菌中, 抗生素合成和孢子形成是由一系列调控基因控制的。丁酰内酯家族内的一些可扩散因子就位于这个等级调控的最顶端。这些分子通过级联调控方式发挥作用, 在调控的最底端就是代谢途径专一性的转录调控因子, 它们可在所有的抗生素产生基因簇中发现。
一个能够加速抗生素生物合成的热稳定因子已从S. clavuliger us 孢子中分离得到, 这个由CA 基因簇ORF7编码的产物同寡肽渗透酶十分相似, 但是否与CA 合成开始的肽转移有关仍需进一步证实。
B -内酰胺酶抑制剂克拉维酸研究进展 孟勇等
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及CA 产量均得到了提高。此现象可通过以下方式解释:我们可以认为CA 合成是精氨酸的一种代谢调控方式, 因为其它生物体中的ArgR 可刺激精氨酸代谢
(抑制精氨酸合成) , 故ArgR 可促进精氨酸在S. clavu -liger us 中向CA 转化。5 提高克拉维酸产量的策略
提高CA 产量是CA 研究的热点课题。在不十分清楚CA 生物合成及调控机制的情况下, 笔者认为利用经典遗传学技术改良菌种为行之有效的提高CA 产量的方略。Choi 等经紫外线和NTG 诱变, 筛选出产量提高10倍的菌株, 又将上述诱变过程得到的Arg 营养缺陷型菌株和Cys 缺陷型菌株进行原生质体融合获得比原始出发菌株CA 产量高出30倍的高产菌株CKD1386。必须指出菌种改良的关键技术在于理性化筛选方法。发酵条件的优化亦是不可或缺的工作。2001年中国药科大学陈向东等[18]采用关联度分析法对CA 发酵培养基组成进行优化, 结果使产酸水平提高1718%。2001年Gouveia 等报道他们对培养基进行优化后, CA 产量可达112g /L 。笔者实验室正从事CA 产生菌(Str ep tomyces clavuliger us ) ATCC27064的改良和发酵条件优化研究, 通过理性化筛选获得的突变株CA 产量可达到018~110g /L, 同时发现甘油、大豆蛋白胨等因素对CA 产量有显著的影响, 深入的研究工作正在进行之中。
随着有关CA 分子生物学知识的积累, 通过基因工程手段改造CA 产生菌将成为可能。因CA 的生物合成受到级联调控, 故某些调控基因(如ccaR 、claR 、bldA 等基因) 的变化可能会使CA 产量获得提高; 另外, 也可通过增加正调控因子或限制步骤酶的拷贝数来增加CA 的产量, 如增加前文所述的ccaR 、claR 、argR 、p ah 等基因的拷贝数。当然亦有人提出:可尝试把整个CA 生物合成基因簇导入到一个异源寄主中, 这样也许会解除CA 生物合所受到的调节使CA 产量增加[20]。
6 结束语
几十年来, 由于抗生素的大量使用, 导致了细菌对很多药物的抗药性, 这已成为临床上治疗细菌性疾病的一个棘手问题。CA, 作为B -内酰胺酶抑制剂, 同B -内酰胺类抗生素联合使用对于杀灭产生B -内酰胺酶的耐药菌有良好的作用。但CA 的抗耐药性功能仅限于产生B -内酰胺酶的耐药菌。且如其它抗生素一样, 随着克拉维酸青霉素复合制剂的应用, 抗性菌株亦开始出现于临床。目前, 人类面临的是如何迎接广泛存在[19]
[17]
4kb 处, 编码由256个氨基酸组成的类ActII -ORF -4调控蛋白, 同通用的调控蛋白(AfsR) 和抗生素专一性调控蛋白(DnrI. RedD. ActII -ORF -4) 具有26%~29%的相同序列。CcaR 属于SARP 类蛋白(Streptomyces antibiotic regulatory protein) , 象OmpR 家族类调控蛋白DNA 结合域的三维结构一样, SARP 蛋白在DNA 结合结构域相应螺旋上也包含大量保守氨基酸。ccaR 的突变将导致头孢霉素C 、CA 或其它克拉维胺合成的停止。尽管头孢霉素C 和CA 这两个B -内酰胺类物质是由完全不同的途经合成的, 但扩增ccaR , 将使头孢霉素C 和CA 产量成倍的增加。
链霉菌中T TA 密码子涉及到由bldA 编码的稀有亮氨酰t -RNA 介导的翻译调控[16]。在S. coelicolor 中, ActII -ORF -4编码的调控蛋白的表达水平受到一个由TTA 密码子调控的基因的调控。与之类似, 编码CcaR 蛋白的32位的亮氨酸密码子, 同样受到bldA 的调控。
claR , 一个B -内酰胺调控基因, 位于CA 基因簇下游3kb 处, 方向与cas2相反。它编码一个4616ku 的多肽, 同许多LysR 家族的转录调控因子具有同源性。其N 端、C 端有两个特征性的DNA 结合域, 螺旋一转角一螺旋基元。claR 基因的扩增将导致CA 和丙酰克拉维胺产量的增加且可极大的减少头孢霉素C 的产生。
ClaR 是一个117kb 的单顺反子的表达产物, 它并不受自身蛋白的调控。其转录产物和car 基因转录产物在ccaR 基因破坏的突变株中均不可见, 而claR 的失活将使car 、克拉维酸基因簇中的ORF9、ORF10的转录物不表达, 并且产生头孢霉素C 合成增加, CA 合成缺失的突变, 但这种突变可积累克拉维胺酸。这表明claR 控制涉及到CA 合成后面步骤的基因, 且ccaR 和claR 的级联调控同时控制着头孢霉素C 和CA 的合成。
目前在lat 基因(头孢霉素合成的第一个基因, 因此也是进行调控的首选基因) 启动子上尚未发现CcaR 结合区。lat 启动子下的报道基因也不受CcaR 的影响, 这表明, 有其它的因子参与了CcaR 和ClaR 之间的级联调控。当然, lat 启动子也可能并不是CcaR 调控的靶点, 基因簇中其它生物合成基因的启动子被用作转录调控靶点的研究正在进行之中。
另外, 通过前体物的可获得性亦可对CA 合成进行间接调控。精氨酸合成基因及抑制精氨酸合成的调控蛋白(ArgR) 已得到了研究。在S. clavuliger us 中
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决耐药性问题的根本途径可能应从耐药性产生的遗传学及生物化学机理中寻找突破口, 利用新的思路去发掘新的抗生素以及细菌细胞中存在的抗生素作用的新靶点, 如包括笔者实验室在内的国内外几家实验室正在进行的以细菌蛋白质分泌功能为靶点的抗耐药性化合物的研究, 很有可能成为解决耐药性问题的有效途径之一
[21]
中国抗生素杂志2003年1月第28卷第1期
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